肝脏IL--6报告基因小鼠模型的建立及其在氧化石墨烯肝脏急性炎症评价中的应用
目的： 石墨烯（graphene）是一种新型的碳纳米材料，其厚度仅为一个碳原子，是世界上最薄的纳米材料。石墨烯由碳原子以sp2杂化轨道排列组成的六角形二维结构组成，每个原子间有很强的作用力，结构非常稳定，具有硬度高，伸展性好等特性，在物理学、生物医药等诸多学科领域有良好的应用前景。氧化石墨烯（graphene oxide,GO）是石墨烯经氧化处理后的衍生物，相较石墨烯具有更强的亲水性及生物相容性，目前研究者们广泛探讨了其在药物递送、肿瘤治疗、光学成像和生物传感器等领域的潜在应用。随着GO材料的广泛应用，其生物安全性问题也备受关注。肝脏是人体中重要的解毒器官，也是纳米材料产生毒性作用的重要靶器官，因此本研究旨在寻找一种可应用于评价纳米材料肝脏急性炎症反应的生物标志物，即通过构建一种可以特异性检测肝脏炎症信号分子的小鼠模型，筛选和评估不同片径GO经尾静脉暴露后的肝脏急性炎症效应，并探讨其相关机制，为GO在生物医药领域的安全应用提供实验支持和理论依据。 方法： 通过水动力高压转染的方法将白介素6(Interleukin-6,IL-6)启动子启动的萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,Fluc)报告基因载体定向转染至小鼠肝脏，构建IL-6报告基因小鼠模型。采用活体生物发光成像监测炎症刺激条件下肝脏Fluc的表达情况，并考察发光强度与肝脏IL-6表达的相关关系。将肝脏IL-6作为指示大、中、小不同尺度GO引起肝脏急性炎症的标志物，使用构建的可视化小鼠模型实时动态监测了大（片径介于500-1000nm,标记为Large,简写为L）、中（片径介于50-500nm,标记为Middle,简写为M）、小（片径介于50-200nm，标记为Small，简写为S）三种尺寸GO纳米材料经尾静脉注射后小鼠肝脏IL-6激活情况，从活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）产生导致的氧化损伤以及纳米材料诱导巨噬细胞极化两方面分析不同尺寸GO激活小鼠肝脏IL-6表达差异的机制，并采用本课题组之前构建的核转录因子NF-κB信号通路可视化小鼠模型探讨GO对IL-6的激活与NF-κB信号通路的相互关系。 结果： 高压水动力法成功将pIL-6-Fluc报告基因递送至小鼠肝脏，约使20%的肝脏实质细胞表达目的基因。该方法可造成一过性的肝损伤，但可在5-7天恢复正常。pIL-6-Fluc可被LPS激活，峰值时可上升46.80±13.35倍，远高于ELISA监测结果（4.09±0.96倍）。NF-κB信号通路阻断剂PDTC可显著抑制LPS诱导的IL-6-Fluc表达,与LPS激活肝脏IL-6信号通路相符。使用上述小鼠模型，分别尾静脉注射S、M、L三种尺寸GO，处理3小时后均可在小鼠肝脏检测到荧光信号，并在约9小时后达到峰值，之后荧光信号强度逐渐下降，在48小时后消失。发现IL-6信号的激活具有剂量依赖性和尺寸依赖性，即GO注射浓度越高肝脏IL-6激活越强，GO尺寸越大肝脏IL-6激活越强。同时，GO尺寸越大引起肝脏ROS及NF-κB信号通路激活越强，ROS抑制剂和NF-κB信号通路抑制剂均可抑制肝脏IL-6的激活，GO激活小鼠肝脏IL-6可能经由ROS→NF-κB→IL-6通路。体外机制研究表明L-GO更多的粘附在巨噬细胞的细胞膜上，直接作用于细胞膜表面，通过TRL-4受体将信号转导入细胞内部，促进巨噬细胞向M1型的极化，分泌大量炎症因子，从而介导炎症反应。 结论： 通过水动力高压转染的方法可将pIL-6-Fluc特异性递送至小鼠肝脏，从而建立了可实时动态监测小鼠肝脏IL-6表达的可视化模型；经验证，该模型可特异性反应IL-6激活，且其灵敏度高于经典的ELISA方法。尾静脉注射大尺寸的GO会引起肝脏更强的肝脏氧化应激反应，继而通过NF-κB信号通路激活小鼠肝脏IL-6表达；同时，体外细胞实验表明大尺寸GO会更多地粘附于巨噬细胞表面，通过TRL-4受体将信号转导从而促进其向M1型极化，并分泌促炎因子激活肝脏IL-6表达。通过以上两方面途径，GO以尺寸及剂量依赖性的方式激活小鼠肝脏IL-6，诱发肝脏炎性反应。 意义： 在基础医学研究中，人们往往采用RT-PCR、免疫组化、ELISA等方法测量肝脏中IL-6的转录或表达水平，然而这些传统的监测方法虽能对IL-6表达水平进行测量，但需各时间点处死实验动物进行肝脏组织取材，不仅操作繁琐、人为因素对实验结果影响大，且无法在同一只实验动物上获得连续观察数据。而本研究构建了一种可实时、动态、无创、高灵敏监测肝脏原位IL-6表达水平的小鼠模型。并以该模型为肝脏炎症性指标，系统评价了不同尺寸及不同浓度GO对肝脏IL-6激活情况的差异，证明了小尺寸GO相较大尺寸GO引起肝脏炎性反应较低，为GO未来在生物医药领域的安全应用提供实验支持和理论依据。
氧化石墨烯;肝脏急性炎症反应;白介素-6;水动力基因转染;安全性
泰山医学院
硕士
临床检验诊断学
江新泉;詹林盛
2017
中文
R318.08
2020-10-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）