苯丁酸与氟康唑联合抗耐药白色念珠菌的机制研究
近年来，侵袭性的念珠菌感染发生率呈现越来越高的趋势。其中白色念珠菌引起的感染是念珠菌感染的重组成部分。三唑类抗真菌药物是治疗白色念珠菌感染的一线药物，由于抗真菌药物的大量应用，使得对唑类敏感的白色念珠菌不断出现耐药的情况，除此以外，对于病情较重的患者，广泛应用呼吸机、各种导管插管在所难免，而白色念珠菌易附着于这些生物材料表面形成生物膜，导致生物膜相关的感染越来愈多，而且生物膜的形成是真菌耐药的重要机制之一，这都给临床治疗带来极大的挑战。研究一个新的抗真菌药物需要巨大的经济投资、耗时多年，并且在此方面中国无法与国外发达的药物研发能力相抗衡；由于目前抗真菌药物品种有限，且大多价格昂贵，使得抗真菌药物之间的联合具有一定局限性。因此，本课题组多年来一直关注老药新作用研究，进行了一系列非抗真菌药物对唑类抗真菌药物的增效作用研究，企图从联合用药的角度找到克服真菌耐药的有效方法。 苯丁酸（Phenylbutyric acid，PBA）已被美国FDA批准治疗尿酸循环障碍，现在正处于探索它对包括胰岛素抵抗、囊性纤维化和枫糖浆尿病在内的多种疾病的治疗阶段，其中该药用于治疗脑肿瘤治疗研究已在第Ⅱ期临床试验中。课题组前期实验结果表明PBA与FLC联合具有体内外协同抗耐药白色念珠菌作用和抗生物膜作用。 本论文将以耐药白色念珠菌为研究对象，借助于倒置荧光显微镜观察药物联用下菌丝形态特征；通过RT-PCR技术深入探讨药物联用对白色念株菌丝相关调控基因、Ras/cAMP/PKA途径中调控因子以及毒性相关基因的影响；利用流式细胞仪研究苯丁酸对白色念珠菌外排泵活性的影响。期望能够找到PBA与FLC的联用抗耐药真菌的具体作用通路和靶点。 1、苯丁酸与氟康唑联用对白色念珠菌生物膜的影响 生物膜形成是白色念珠菌的常见耐药机制之一。本实验分别利用PCR技术和倒置荧光显微镜从基因表达水平和菌丝形态的变化两个角度探究了苯丁酸与氟康唑联用对白色念珠菌生物膜的影响。荧光显微镜观察实验共分为四组，对照组，氟康唑单用组，苯丁酸单用组，药物联用组。将菌液分别加入四组的六孔板中使其终浓度为1×103CFU/mL，然后对应加入不同药物。对照组不做药物处理，氟康唑浓度为1μg/ml，苯丁酸浓度为32μg/ml。将六孔板放入恒温培养箱，在35℃的下，恒温培养24h。通过倒置荧光显微镜观察。本实验通过实时定量PCR（Real Time-PCR,RT-PCR）的方法对菌丝相关调控基因（ALS1、ALS2、ALS3和HWP1）及其上游调控通路Ras/cAMP/PKA信号通路相关基因（RAS1、CYR1和TPK2）表达水平进行测定。基因的表达水平用2–△△Ct法进行数据分析，△CT=目的基因的表达量-内参基因的表达量。 结果表明，倒置荧光显微镜观察到药物联用组菌丝生长被抑制，其数量明显少于对照组及药物单用组。基因检测结果显示，药物联用组与FLC单用组比较ALS1，ALS3均明显表达降低，HWP1表达变化不明显。Ras/cAMP/PKA信号通路相关调控基因中，药物联用组与FLC单用组比较CYR1，TPK2和EFG1基因表达下调，RAS1未受影响。 另外，很多研究已经表明生物膜胞外基质（ECM）能够减缓药物的渗透，还通过“三明治”实验从药物的透膜能力方面探索了苯丁酸与氟康唑可能存在的抗耐药白色念珠菌的协同机制。将提前紫外灭菌的载体膜放入YPD固体培养基中，用可调式移液枪吸取40μl菌液，滴入载体膜，将培养基放于恒温培养箱，35℃培养24小时，制成生物膜模型。将获得的生物膜取出分别放入加药培养基中，然后加盖一层0.22μm直径10mm的纤维滤膜，然后取一直径为6mm的纸片，用水润湿后放在滤膜上。制成三明治模型，将此系统放入恒温培养箱35℃培养24h。取出三明治系统中的直径6mm的纸片，将其置于制备好的菌板培养基之上，放入恒温培养箱，温度为35℃恒温培养24小时，观察并测量抑菌圈直径的大小。结果证明，苯丁酸能增强氟康唑透过生物膜的能力。 2、苯丁酸与氟康唑联用对耐药白色念珠菌毒力的影响 近年来，越来越多的研究发现，分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAP）和细胞外磷脂酶是在致病机理中起到重要作用的两种毒力因子。在本节实验中，选择了SAP1、SAP2、SAP3和SAP4四个编码分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAP）的主要基因，通过RT-PCR测定其表达量；另外，使用卵黄胚胎培养基测定不同药物干预后，白色念珠菌胞外磷脂酶的活性变化。 结果表明，胞外磷脂酶实验结果显示药物联用组沉淀圈小于对照组及单用组，Pz值显示联用组磷脂酶活性最低。毒性相关基因表达测定结果中，药物联用组与FLC单用组比较，毒性相关基因SAP1、SAP2、SAP3和SAP4基因表达下调。 3、苯丁酸与氟康唑联用对白色念珠菌外排泵的影响 由于常见的耐药机制还与白色念珠菌的外排增加有关，本实验分别利用RT-PCR技术和罗丹明6G外排实验从基因表达水平和蛋白活性的变化两个角度探究苯丁酸是否减弱了耐药白色念珠菌对氟康唑的外排。通过流式细胞仪罗丹明6G外排实验，探究苯丁酸能不能抑制白色念珠菌外排泵的活性，并利用RT-PCR技术测定外排耐药基因CDR1，CDR2和MDR1的表达变化。 罗丹明外排实验结果表明，加入5%的葡萄糖后，对照组和加入苯丁酸的实验组的荧光强度均呈现出随时间逐渐下降的趋势，可能与加入葡萄糖后细胞获取能量，导致部分罗丹明6G的排出有关。但两组之间相比，加药组对罗丹明6G的外排并无较大影响。RT-PCR结果显示，与对照组相比，氟康唑单用组基因表达上调。苯丁酸单用组与对照组相比几乎没有变化。联用组与对照组相比并无明显变化。由此推测，苯丁酸和氟康唑协同作用机制与降低药物外排无关。 综上所有实验证明，苯丁酸与氟康唑联合抗耐药白色念珠菌的协同机制主要可能与抑制生物膜的形成，促进氟康唑透过生物膜进入菌细胞和减弱真菌的毒性因子如磷脂酶、分泌型天冬氨酸蛋白酶的活性有关。
白色念珠菌感染;氟康唑;苯丁酸;联合用药;抗真菌机制
泰山医学院
硕士
临床药学
孙淑娟
2017
中文
R519.3;R978.5
2020-10-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）