APRIL及其mRNA在非小细胞肺癌(NSCLC)中的调控机制研究
肺癌是临床常见的恶性肿瘤。据统计学数据显示，每年中国因肺癌死亡的人数多达数十万，逐渐上升的发病率及居高不下的死亡率，使得肺癌越来越受到人们的关注和重视。肺癌的分类方式有多种，按照病理学分为两大类，一类是小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC），具有神经内分泌功能，治疗和预后有着明显不同；另一类为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），包括腺癌、鳞癌及大细胞癌等。研究证实，非小细胞肺癌的发病率要远远高于小细胞肺癌，超过80%以上。近年来，虽然NSCLC在诊断和治疗上有了较大的进步和发展，但患者的5年存活率仍未超过15%。 APRIL，即增殖诱导配体（a proliferation-inducing ligand），是一种Ⅱ型跨膜蛋白质，由位于染色体的17p13.1基因转录翻译而来，属肿瘤坏死因子超家族（TNFSF）配体新成员，最初于上世纪90年代末被Hahne等人发现并克隆。除部分正常的免疫细胞（如B淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞等）外，人体正常组织中几乎检测不到APRIL表达，但在诸如肝癌、结肠癌、白血病及淋巴瘤等多种癌组织中其表达丰度颇高。现已明确，APRIL有两个特异性受体，分别为BCMA（B-cell maturation antigen,B-细胞成熟抗原）、TACI（transmembrane activator and CAML interactor,穿膜活化蛋白）；APRIL与受体结合也分两种形式：可溶型及膜结合型。APRIL-BCMA-TACI配、受体结合后可调控机体免疫应答、刺激淋巴细胞成熟与活化等。近年来，随着对APRIL-BCMA-TACI研究的深入，人们发现该体系还能够促进癌细胞增殖、迁移、扩散，并高表达在NSCLC中。同时在体外肺癌细胞系A549细胞实验中，APRIL可影响肿瘤细胞部分酶系体系的活化及某些信号途径的跨膜转导，从而产生明显的生物学效应。以上种种研究都在提示，APRIL-BCMA-TACI体系在肺癌，尤其是非小细胞肺癌的整体布局中占有非常重要的地位。 目的： 本研究主要目的是检测在不同的组织和取材部位（NSCLC癌组织、癌旁正常组织、外周血液）中APRIL及其受体BCMA-TACI不同的表达情况，一并统计与分析APRIL-BCMA-TACI体系在不同组织当中含量的不同与NSCLC患者各种临床病理参数之间的相关性；采取体外实验观察肺癌细胞增殖、迁移及跨膜信号转导途径受APRIL-BCMA-TACI体系的影响变化情况，来探索研究NSCLC中APRIL及其受体BCMA-TACI相关作用机制，以期指导临床治疗，并为开发肺癌新的治疗方式提供一定的理论基础。 方法： （1）采取免疫组化染色法检测80例NSCLC病人APRIL及其相关受体TACI和BCMA在癌组织及癌旁组织中的表达情况。 （2）将H1299和A549肺癌细胞系用shRNA干扰技术敲除BCMA和TACI基因的表达，检测上述肺癌细胞在缺失BCMA和TACI受体的情况下于体外培养过程中细胞的增殖有无变化，方法采用CCK-8。 （3）将H1299和A549肺癌细胞株分别用空质粒及BCMA-TACI-shRNA质粒进行转染，检测转染后上述细胞的生长、迁移受APRIL的影响变化情况，方法采用细胞划痕法。 （4）采取实时荧光定量PCR检测APRIL、BCMA及TACI mRNA在正常人外周血液及NSCLC患者外周血液中的表达情况。 （5）选取H1299和A549肺癌细胞系细胞，用shRNA技术抑制BCMA和TACI基因的表达，将APRIL作用于无BCMA和TACI受体的A549细胞和对照组细胞，检测是否影响到细胞MAP激酶ERK1/2信号磷酸化水平，方法采用Western blot。 结果： （1）免疫组化染色结果显示，APRIL蛋白主要在细胞的胞浆中被染色。APRIL蛋白在80例NSCLC癌组织中72.50%(58/80)的阳性表达率明显高于癌旁正常组织中的11.25%(9/80)，两组数据结果经统计学分析，所得P＜0.05，被认为存在统计学意义。 （2）免疫组织化学染色APRIL的表达与NSCLC临床病理特征间存在相关性：NSCLC患者的性别、年龄、组织学分型并不影响APRIL蛋白的表达，统计学结果显示P＞0.05；但肿瘤大小、分化程度及淋巴结有无转移却显著影响到APRIL在不同组织当中的含量（P＜0.05）。 （3）NSCLC患者中TACI蛋白阳性表达率比对癌旁正常组织明显升高（P＜0.05），存在统计学差异；就其与临床病理特征相关性分析见：NSCLC病人的年龄、性别、肿瘤大小、分化程度及淋巴结有无转移并不影响TACI在不同组织当中的含量表达（P＞0.05），但是腺、鳞癌这种不同的肿瘤组织学分型却明显影响到TACI的含量表达，统计结果P＜0.05。 （4）NSCLC患者中BCMA蛋白阳性表达率比对癌旁正常组织明显升高（P＜0.05），存在统计学差异；就其与临床病理特征相关性分析，NSCLC患者的年龄、性别、肿瘤大小、组织学分型及分化程度均不影响BCMA蛋白的表达（P＞0.05），但淋巴结有无转移却显著影响到BCMA蛋白的阳性表达（P＜0.05）。 （5）体外实验证实：H1299和A549肺癌细胞在接受APRIL作用后，划痕边缘及划痕正中，细胞密度增加、簇集趋势明显增强，但对于接受shRNA转染影响的H1299和A549细胞（即BCMA和TACI基因表达被干扰），实验结果显示，划痕边缘及正中，细胞密度小，簇集与迁移趋势弱。 （6）人肺癌细胞系H1299和A549细胞染色体中的受体基因被人为抑制转录和翻译之后，其细胞结构内不再表达BCMA和TACI，此时经APRIL作用，细胞爬行切片染色后，实时动态观察可见，染色细胞数目及密度增加趋势发生了较为明显的变化，24h后A549细胞首先表现出下降趋势，48h后H1299细胞也被观察到间隔相同时间后，染色细胞数目增长速度减缓。经统计学分析，两细胞出现的这种扩增变慢的现象具有统计学意义（P＜0.05）。 （7）实时荧光定量PCR结果显示：不同组别间APRIL mRNA的表达水平相互比较，非小细胞肺癌患者外周血液实验组数值升高的程度存在统计学意义（P＜0.05）。分析不同的临床特征和病理参数与APRIL mRNA在外周血中含量高低有无关联性，结果可见：NSCLC患者年龄、性别、病理类型、病理分期并不干扰血液中APRIL mRNA的含量变化（P＞0.05），但有无淋巴结转移及肿瘤不同的分化程度明显影响了APRIL mRNA的含量（P＜0.05）。BCMA mRNA含量不受任何NSCLC患者临床特征及病理参数的影响，而TACI mRNA外周血中的含量在淋巴结转移组及肿瘤低分化组明显升高，且这种差异存在统计学意义（P＜0.05）。 （8）A549细胞中经MAPK、ERK1/2所介导的跨膜信号转导在接受APRIL作用后明显增强，比较阴性对照组，所得统计学结果P＜0.05，提示存在统计学意义。但APRIL却不能提高BCMA和TACI基因表达被干扰后的A549细胞系MAPK以及ERK1/2的磷酸化程度，所得P＞0.05。 结论： （1）NSCLC患者肿瘤的发生、发展、浸润和转移与组织中APRIL及其相关受体TACI、BCMA的高表达存在相关性。 （2）APRIL mRNA在NSCLC患者外周血中高丰度表达，且与肿瘤患者的部分临床病理参数存在关联性，提示可将该项指标用于指导临床诊断、判断预后及复发。 （3）可溶型APRIL及BCMA-TACI蛋白在体外实验中可促进肺癌细胞生长、分化、迁移等，提示肺癌的发生和发展过程中有APRIL-TACI-BCMA机制参与，而活化MAPK、增强ERK1/2磷酸化途径可能为其发挥分子生物学效应的机制之一。 （4）本实验研究为后期多因子联合检测提高NSCLC的诊断与治疗提供一定理论基础。 意义： NSCLC癌组织、转移淋巴结及外周血中APRIL、BCMA和TACI的高水平表达，及其与临床病理参数之间的关联性，提示APRIL-BCMA-TACI体系及其影响的ERK1/2磷酸化可能参与到人类肺癌的调控机制中；因此，进一步研究该机制，以及与之存在共性或相关性的其他细胞因子或肿瘤标记物，对非小细胞肺癌的诊断和治疗具有重要的意义。APRIL-BCMA-TACI mRNA检测、联合其他细胞因子共同检测或可增加外周血液检测肺癌的敏感性，为NSCLC早期诊断和后期多方向综合治疗提供帮助。
非小细胞肺癌;增殖诱导配体;信使核糖核酸;穿膜活化蛋白;病理参数;临床预后
泰山医学院
硕士
外科学
许孝新
2017
中文
R734.2
2020-10-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）