光纤SERS探针探究单细胞水平的代谢事件
细胞代谢是生命体维持运转的主要途径，癌细胞有着区别于正常细胞的特殊代谢机制，即有氧糖酵解。癌细胞在代谢过程中，会产生一系列生物标志物，由于癌细胞之间具有异质性，因此，在单细胞水平检测或识别这类生物标志物对于了解代谢途径具有重要意义。在探究单细胞新兴分析技术的过程中，研究者们发展了一大批高时空分辨的，无损快速的，来自光，电，力，质等多个谱学的检测手段。技术的发展为研究单细胞的动态过程带来了契机。 表面增强拉曼散射（SERS）在单细胞分析方面具有很大的优势：SERS的灵敏度高，可以允许无标记的指纹分析；拉曼活性分子可进行标记间接检测，且稳定性高不受激光的干扰。纳米针尖技术最开始应用于电生理分析的膜片钳以及近场光学显微镜的扫描探针，在结合光谱检测平台后，发挥了更大的功能，可以实现在自然状态下研究单细胞内部的动态生物过程。该领域逐渐成为研究热点。 为了实现单细胞的光生理分析，本文首先搭建了微操作-拉曼光谱检测仪器，提供微操作技术的可控定位功能以及拉曼光谱检测技术。进一步地，利用管状刻蚀方法将石英光纤的末端处理为500nm以下的锥形针尖，保证针尖在插入细胞后避免物理机械带来的损伤。通过激光诱导沉积方法在针尖表面修饰SERS基底和拉曼活性分子，探讨了单分子层的沉积过程并优化了沉积时间来实现最佳的SERS增强。在性能测试中，利用不同光纤SERS探针检测到的SERS光谱强度基本一致。在检测了几十组细胞后，探针分子的强度仍能稳定。细胞在经历插入，拔出后，对其进行了活细胞死细胞染色，荧光显微镜下的绿色荧光表明细胞仍存活。在不同激发收集方式的探讨中，本文对比了光纤激发和物镜激发对检测效率的影响，并计算了增强因子，优化了检测方式。光纤SERS探针的重复性，稳定性及细胞毒性测试表明该探针在细胞体系应用的可能。 本文制备了SERS光纤探针，以一种正常细胞和三种癌细胞系作为模型，实现了单细胞内外，以及亚细胞区域的光生理检测。癌细胞有氧糖酵解的最终表现为乳酸的释放，而糖酵解过程又涉及诸多氧化还原反应的参与。因此在探究单细胞的代谢事件中，本文分别检测了pH及氧化应激水平。在pH检测中，4-巯基吡啶作为响应探针，它在不同酸碱度下会呈现不同的SERS光谱。基于这个原理，单细胞微环境的pH数据得到了表征，本文进一步解析了正常细胞与癌细胞内外环境的pH差异，相比于正常细胞，癌细胞表现为内环境偏高，外环境偏低，这个结果与普遍研究一致。在三种癌细胞的代谢特征探究中，分别检测了细胞核，细胞质的pH水平，利用p值（显著性分析）计算了核质区域的差异性。进一步地，将单细胞数据处理为散点图，从多个角度分析了单细胞pH的分布特征。在氧化应激检测中，4-羟基苯硫酚作为氧化还原探针，得到了氧化曲线与还原曲线，并测试了探针的循环性能及在细胞中应用的普适性，最后探究了药物PMA刺激下细胞外环境随时间变化的氧化应激事件。
光纤探针;面增强拉曼散射;制备工艺;单细胞代谢;临床检测
吉林大学
硕士
物理化学
徐蔚青
2020
中文
TQ421.7
2020-09-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）