基于多反应监测质谱法对水稻功能蛋白绝对定量分析方法的研究
定量分析作物群体、组织和细胞以至亚细胞中蛋白质表达水平，对于揭示作物生长发育过程及其逆境胁迫响应的重要生理代谢与品质产量调控规律具有十分重要的理论意义。然而，传统的蛋白质定量技术方法普遍存在着蛋白分析灵敏度低、线性范围窄、基质干扰严重等诸多问题，这在很大程度上制约着从蛋白水平上对作物有关生理过程及其相关代谢机制的深入认识。本文基于多反应监测(MRM)质谱分析技术，结合蛋白酶解、净化和同位素标记等方法的应用，建立了适用于水稻功能蛋白的绝对定量方法，并成功实现了水稻籽粒中Glb33蛋白的绝对定量。主要研究结果如下： 1、开发了16种典型水稻叶片蛋白的MRM质谱分析方法。以实际监测到的16种典型水稻蛋白为研究对象，对其酶解特征肽段进行选择和质谱条件优化。结果表明，以乙腈和0.1%(v/v)甲酸水溶液为流动相结合二元梯度洗脱，16种肽段在Poroshell120EC-C18色谱柱上获得良好的分离；在0.02~500nM范围内，各肽段浓度与质谱响应值呈良好的线性关系，相关系数均大于0.99；仪器的检出限和定量限范围分别达到0.007~0.5nM和0.02~1.5nM。 2、确立了高效的表面活性剂辅助沉淀/颗粒酶解(SOD)蛋白提取方法。以16种靶蛋白为研究对象，优化了提取缓冲液、蛋白质沉淀试剂和酶解条件。结果表明，以含1%SDS的缓冲液为蛋白提取试剂，再将丙酮沉淀法获得的总蛋白经1∶50(酶∶蛋白质，w∶w)胰蛋白酶酶解，当酶解pH值为8.0，温度为48℃，水解4~8h可达到最佳酶解效率。与传统酚法和TCA-丙酮法相比，本研究建立的方法酶解时间短、操作简便，不仅能有效提高16种靶蛋白质的分析灵敏度，也可有效避免目标蛋白质的损失。 3、建立了最佳固相萃取净化技术。选取C18、MAX、MCX、HLB和SD-C18等5种固相萃取柱，系统研究了它们对不同肽段的吸附能力及除干扰等性能。结果发现，SD-C18柱对不同特征肽段均有较强的保留能力，采用70%乙腈溶液洗脱，各肽段的洗脱回收率均可达80.1%~105.7%之间。此外，实验结果发现当酶解肽段直接进样分析时，多数肽段表现为中等强度的基质抑制效应(ME值介于-50%~-20%)，而当酶解液经SD-C18柱后，基质效应降低至±20%以内，基本满足分析要求。 4、不同长度侧翼内标肽段影响定量结果的准确性。以OsGSTF14和Glb33的特征肽段为研究对象，通过人工合成不同长度侧翼序列的同位素标记肽段，讨论侧翼氨基酸数目对蛋白质绝对定量结果的影响。结果表明，侧翼氨基酸个数为6时，基本能模拟内源蛋白质在样品中的酶解和溶解特性，其校正回收率均达到92%以上，从而有效提高相应蛋白的定量准确性。 5、将LC-MS/MS的MRM质谱技术成功应用于水稻籽粒中过敏蛋白Glb33的绝对定量。结果表明，检测的24个水稻品种中过敏蛋白Glb33含量差异较大，范围在11.7~682.0μg/g之间，该方法为水稻及制品中的过敏蛋白质筛选分析提供提供重要的技术支撑。
水稻;功能蛋白;多反应监测;同位素标记内标肽段
浙江大学
博士
作物学
程方民
2019
中文
S511.034
2020-07-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）