家族遗传性胆固醇结石患者肝脂质代谢遗传与基础研究
目的：本课题研究脂代谢相关基因在汉族人群家族遗传性胆固醇结石(HCGD)患者肝组织中表达的变化，以期筛选出与HCGD发病相关基因。同时，通过对一个HCGD家系进行全基因组外显子测序(WES)探寻家系患者共有的突变基因及位点，生物信息学分析方法筛选候选基因，以期发现HCGD的致病基因或新的易感基因位点。在此基础上，探讨茵陈蒿汤配方颗粒剂(YCHD )防治C57BL/6J胆囊胆固醇结石小鼠胆石形成及可能的机制。 方法：第一部分：收集9例HCGD患者(HCGD组)、9例散发性胆固醇结石患者(SCGD，SCGD组)和7例无胆石病肝血管瘤患者(对照组)血液与手术肝组织标本。采用酶法检测血清脂代谢相关指标:总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、载脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白B(ApoB)、脂蛋白Lp(a)、总胆汁酸(TBA)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定肝组织7个核受体(NRs)：肝X受体(LXRα)、法尼醇X受体(FXR)、甾醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)、雌激素受体α/β(ERα/β)、G蛋白偶联受体30(GPR30)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)，3个合成酶基因3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)、胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)、胆固醇12α羟化酶(CYP8B1)和8个膜转运体基因ATP结合盒B亚家族成员4转运蛋白(ABCB4)、ATP结合盒B亚家族成员11转运蛋白(ABCB11)、顶端钠依赖性胆酸转运体(ASBT)、有机溶质转运体α(OSTα)、有机溶质转运体β(OSTβ)、胆汁酸结合蛋白(ILBP)、三磷酸腺苷结合盒转运体蛋白家族5/8(ABCG5/G8)、尼曼匹克C1样蛋白(NPC1L1)mRNA的表达。第二部分：收集一个4代共18例非近亲婚配的HCGD家系并绘制系谱图，采集HCGD家系中4例CGD患者(Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ6和Ⅲ2)和1例家系内正常对照(Ⅲ3)外周静脉血，采用试剂盒抽提外周血有核细胞全基因组DNA(gDNA)后进行WES，通过生物信息学分析并过滤千人基因组数据库中MAF≥1%的变异，过滤华大基因内部对照数据库以去除系统假阳性，同时过滤家系内正常对照个体(Ⅲ3)中存在的突变基因或变异位点以筛选出家系内与CGD相关的候选基因/位点。筛选出的候选基因/位点通过SIFT、PolyPhen、RadialSVM、FATHMM、LR进行生物功能分析以预测变异的致病性。第三部分：40只健康雄性C57BL/6J小鼠适应性饲喂2周后，致石饲料连续喂养8周建立小鼠CGD模型。随机分为正常对照组(NG)、胆石组(LD)、胆石组+熊去氧胆酸组(LD+UDCA)、胆石组+茵陈蒿汤配方颗粒组(LD+YCHD)，NG组饲喂普通饲料，其余各组均饲喂致石饲料。各实验组动物连续给药8周后内眦静脉取血、收集肝组织及胆囊胆汁标本，红外光谱分析法定性胆囊结石成分，体视显微镜观察成石状况及肝组织和胆囊胆汁大体变化，酶法检测小鼠血清脂质及胆汁脂质成分并计算胆汁胆固醇饱和指数(CSI)，肝组织HE染色及油红O染色观察肝脏组织病理形态变化及肝细胞内脂质变化情况，采用qRT-PCR检测小鼠肝脏组织中核受体基因Srebp2、Erα、Erβ、Gpr30和HmgcrmRNA的表达变化。 结果：第一部分：HCGD组血清总胆汁酸(TBA)含量较对照组与SCGD组明显降低(均p＜0.05)，其余脂代谢相关指标各组间均无统计学差异(均p＞0.05)。qRT-PCR检测结果显示(1)与对照组比较，HCGD组ERα/β、SREBP2、PPARγ和NPC1L1的mRNA表达量明显升高，SCGD组FXR、OSTα和ILBPmRNA表达明显升高(均P＜0.05)，SCGD组CYP7A1mRNA表达明显下降(P＜0.05)；(2)核受体LXRα和GPR30mRNA，合成酶受体CYP8B1和HMGCRmRNA，膜转运体受体ABCB4、ABCB11、ASBT、OSTβ、ABCG5、ABCG8在各组间均无统计学差异(均p＞0.05)；(3)HCGD组中ERα和ERβmRNA表达与患者血清TBA水平呈负相关(r=-1.000，P=0.000;r=-0.989,P=0.011)。第二部分：胆固醇结石在该家系中垂直传递，每代均有发病，Ⅰ代共2例，CGD患者为1例；Ⅱ代共6例，CGD患者为2例；Ⅲ代共6例，CGD患者为1例。通过WES后进行生物信息分析及逐步滤过后发现4例CGD患者(Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ6和Ⅲ2)共有而家系内正常对照(Ⅲ3)没有的突变基因为5个：ESPNP、SORCS2、MUC16、BAGE3、PI4KA。但未发现4例CGD患者共有的SNVs变异位点。其中，先证者(Ⅲ:2)与其姑姑(Ⅱ:6)存在5个共同的突变位点ESPNP(n.1440C＞G),PI4KA(c.6083+184A＞G)，MUC16(c.36796-24C＞T；c.37698C＞T:p.Ser12566Ser；c.40203C＞T:p.Pro13401Pro)；先证者(Ⅲ:2)与母亲(Ⅱ:4)存在4个共同突变位点SORCS2(c.1072-32C＞T，c.3311+913C＞T)、MUC16(c.20694T＞C:p.His6898His，c.36067+50C＞A)；先证者(Ⅲ:2)与其父亲(Ⅱ:3)和姑姑(Ⅱ:6)存在1个共同突变位点MUC16(c.41946-168A＞G)；Ⅱ:3和Ⅱ:6具有共同的突变位点BAGE3(c.14T＞C：p.Val5Ala)。发现先证者(Ⅲ:2)MUC16基因2个错义突变(c.38224A＞T：p.Thr12742Ser)，SIFT=0预测为具有危害性；MUC16(c.40204A＞C：p.Lys13402Gln),PolyPhen2=0.974预测为具有危害性。MUC16基因和SORCS2基因是否为HCGD致病基因还有待于进一步的验证。通过功能分析，我们猜测MUC16基因为候选致病基因的可能性大。第三部分：体视显微镜观察显示NG组成石率为0%(0/10)，LD组成石率为100%(10/10),UDCA及YCHD干预组成石率分别为30%(3/10)和40%(4/10)；红外光谱分析法定性为胆固醇结石。与NG组相比，LD组小鼠体质量、血清TG和TC水平、胆囊胆汁胆固醇(Ch)、胆汁磷脂(PLs)和胆固醇饱和指数(CSI)均明显升高(均P＜0.01)；血清HDL-C和TBA水平，胆汁胆汁酸(BAs)水平显著降低(均P＜0.01)；LDL-C未见明显差异(p＞0.05)。与LD组相比，UDCA组和YCHD组小鼠体质量、血清TG和胆汁CSI均明显降低(均P＜0.01)，血清TBA、胆汁PLs和BAs均明显升高(均p＜0.05)，UDCA组TC和LDL-C未见明显差异(均p＞0.05)；YCHD组血清TC和TG明显降低(均p＜0.05)，HDL-C和LDL-C未见明显差异。连续给药8周后，HE染色和油红染色O显示，与NG组相比，LD组肝组织轻度脂肪变和炎性细胞浸润；与LD组相比，UDCA组和YCHD组肝组织脂肪变性减轻，炎性细胞浸润减少。qRT-PCR结果显示：与NG组相比，LD组Erɑ和HmgcrmRNA表达明显升高(均P＜0.01)，Gpr30mRNA表达明显降低(p＜0.05)，ErβmRNA表达无显著性差异(p＞0.05)；与LD相比，UDCA组Gpr30mRNA表达明显升高(P＜0.01)，Srebp2、Erα、Erβ和HmgcrmRNA表达无显著性差异(p＞0.05)。YCHD组Srebp2和ErɑmRNA表达明显降低(均p＜0.05)，ErβmRNA表达明显升高(P＜0.01)，Gpr30和HmgcrmRNA表达无显著性差异。 结论：1、核受体基因ERα/β、SREBP2、PPARγ及膜转运体基因NPC1L1在HCGD患者肝组织中表达上调，其高表达可能参与了HCGD的发生发展。其中，SREBP2、PPARγ在HCGD发病与SCGD发病中可能存在不同的调控机制。肝脏中“ESRɑ-SREBP-2”的调节通路可能参与了HCGD的发生。2、MUC16、SORCS2基因可能是HCGD家系的一个新的致病基因,新突变位点MUC16(c.38224A＞T/p.Thr12742Ser)和MUC16(c.40204A＞C/p.Lys13402Gln)的检出丰富了MUC16基因的突变谱。3、YCHD通过“ERα-SREBP2”途径，下调ERα和SREBP2mRNA的表达，改善肝脏的病理性损伤及肝内脂质沉积，调节血脂中HDL-C和TG，降低胆汁Ch和CSI和升高BAs，改善胆汁致石性从而防治小鼠CGD形成。
家族遗传性胆固醇结石;肝脂质代谢;易感基因位点;生物信息学分析;茵陈蒿汤配方颗粒剂
天津医科大学
硕士
中西医结合
崔云峰
2019
中文
R575.62;R285.5
2020-07-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）