基于Notch信号通路探讨穿龙薯蓣皂苷治疗再生障碍性贫血疗效及机制研究
目的：构建再生障碍性贫血小鼠模型，观察穿龙薯蓣皂苷对再生障碍性贫血小鼠的治疗作用，探讨穿龙薯蓣皂苷是否可通过调节再生障碍性小鼠Notch信号通路影响Th17/Treg细胞平衡，进而发挥调节免疫促进造血的治疗作用。 方法：1.再障小鼠模型的建立及评估：采用照射联合化学药物损伤法建立再生障碍性小鼠模型。将BALB/c雄性小鼠随机分为对照组(n=10)和模型组(n=60)，模型组小鼠经137Cs照射后，于第4、5、6天腹腔注射环磷酰胺(25mg/kg/d)和氯霉素(62.5mg/kg/d)。对照组予铅砖屏蔽行假照射，腹腔注射等体积生理盐水。第7天检测造模小鼠的血常规、骨髓细胞涂片进行模型评估，外周血白细胞、血红蛋白、血小板、网知红细胞计数下降至正常血象一半以下，且骨髓细胞涂片显示骨髓增生减低或重度减低，视为成模。2.观察穿龙薯蓣皂苷对再障小鼠的药效学研究：将成模小鼠随机分为6组：模型组，穿龙薯蓣皂苷低、中、高剂量组(37.44，74.88，149.76mg/kg/d)，雷公藤多苷组(9.36mg/kg/d)，环孢素组(23.5mg/kg/d)，模型组和对照组予等体积蒸馏水，灌胃14天。第22天检测各组小鼠外周血细胞计数、骨髓细胞涂片评价骨髓增生情况。3.穿龙薯蓣皂苷调节AA小鼠Notch信号通路的机制研究：灌胃结束后，采用FCM法检测各组小鼠外周血Th17、Treg占CD4+T细胞的比值，分析穿龙薯蓣皂苷对AA小鼠Th17/Treg免疫细胞平衡的影响；Q-PCR、Western-blot法检测各组小鼠脾脏RORγt、Foxp3、Notch1、Jagged1、Dll4、RBP-JκmRNA和蛋白表达，探究穿龙薯蓣皂苷对AA小鼠Notch相关信号表达的影响；IP检测RBP-Jκ分别与RORγt、Foxp3蛋白结合量，探讨穿龙薯蓣皂苷是否可通过调节Notch信号通路干预AA小鼠Th17/Treg细胞平衡，进而发挥促造血的作用机制。 结果：1.模型组小鼠外周血WBC、Hb、PLT、RET计数明显低于对照组(P＜0.05)，各治疗组小鼠较模型组血象均有不同程度回升，以穿龙薯蓣皂苷中剂量组和环孢素组疗效较佳。2.与对照组小鼠相比，模型组小鼠骨髓增生低下，骨髓细胞数量减少。经治疗后，各组小鼠较模型组骨髓细胞数量增多，骨髓增生活跃。穿龙薯蓣皂苷中剂量组、高剂量组及环孢素组效果较佳。3.与对照组相比，模型组小鼠外周血Th17细胞占CD4+T细胞比值增多(P＜0.05)，Treg细胞占CD4+T细胞比值减少，Th17/Treg细胞比值上升(P＜0.05)，差异有统计学意义。与模型组相比，各治疗组出现相同的趋势，即Th17细胞所占比值下降、Treg细胞所占比值上升，穿龙薯蓣皂苷中剂量组小鼠外周血中Th17/Treg细胞比值下降显著(P＜0.01)，但Treg上升不明显，与环孢素组相比无统计学意义(P＞0.05)。4.与对照组小鼠相比，模型组小鼠脾脏Notch1、Foxp3、Jagged1mRNA与蛋白表达水平降低(P＜0.05)，Dll4、RORγtmRNA与蛋白表达升高(P＜0.05)。经治疗后，各组小鼠脾脏Notch1、Foxp3、Jagged1mRNA与蛋白表达水平存在不同程度升高，Dll4、RORγtmRNA与蛋白表达水平存在不同程度降低，以穿龙薯蓣皂苷中剂量组和环孢素组最为明显(P＜0.05)。对照组、模型组及各治疗组间小鼠脾脏RBP-JκmRNA和蛋白表达均无统计学差异(P＞0.05)。5.与对照组相比，模型组RBP-Jκ与RORγt蛋白结合量增多(P＜0.05)，RBP-Jκ与Foxp3蛋白结合量降低(P＜0.05)。经治疗后，与模型组相比，穿龙薯蓣皂苷中剂量组、环孢素组RBP-Jκ与RORγt蛋白结合量降低(P＜0.05)，RBP-Jκ与Foxp3蛋白结合量增多(P＜0.05)，差异存在统计学意义。 结论：穿龙薯蓣皂苷能够显著升高及维持再生障碍性小鼠外周血中WBC、Hb、PLT、RET计数水平，增加骨髓细胞数量，改善骨髓造血功能。其可能作用机制为：穿龙薯蓣皂苷可抑制再障小鼠体内Th17细胞数量及转录因子RORγt的表达，提高Treg细胞数量及转录因子Foxp3的表达水平，促进Th17/Treg细胞比例恢复平衡，促进机体免疫稳态的恢复。而Notch信号可参与这一过程，穿龙薯蓣皂苷通过影响再生障碍性贫血小鼠体内Notch1信号受体及Dll4、Jagged1配体的表达水平，进而影响下游信号的转导，并且Notch信号中RBP-Jκ可直接结合RORγt、Foxp3蛋白，穿龙薯蓣皂苷可能通过提高Notch中RBP-Jκ与Foxp3蛋白结合量、降低RBP-Jκ与RORγt蛋白结合量，进而促进Th17/Treg细胞免疫平衡的恢复。
再生障碍性贫血;穿龙薯蓣皂苷;Notch信号通路;免疫调节;临床疗效
天津医科大学
硕士
中西医结合
刘宝山
2019
中文
R285.5;R556.5
2020-07-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）