清胰汤调控DAMPs对SAP-ALI大鼠的治疗机制及对肠道微生态调整的初步探讨
目的： 观察重症急性胰腺炎(SAP)伴急性肺损伤(ALI)大鼠经清胰汤灌胃治疗后血浆中线粒体DNA(mtDNA)水平和肺组织甲酰肽受体(FPR)活化以及炎症损伤改变情况，探讨清胰汤通过调控损伤相关分子模式(DAMPs)对重症急性胰腺炎伴发急性肺损伤(SAP-ALI)大鼠的保护作用机制；通过微生物16SrDNA测序技术检测大鼠粪便中微生物菌群改变，初步探讨清胰汤对重症急性胰腺炎大鼠肠道微生态的调整作用。 方法： 1.清胰汤调控DAMPs对SAP-ALI大鼠肺组织器官损伤治疗机制的研究 将30只SPF级健康雄性Wistar大鼠按照随机数字法分为对照组、模型组、清胰汤组各10只。清胰汤组在实验前一周给予清胰汤10mL/kg灌胃，其余两组给予等量的生理盐水。清胰汤组与模型组在大鼠胆胰管内逆行注射牛磺胆酸钠制作模型；对照组仅在开腹后轻轻翻动胰腺，即关闭腹腔。24h后，颈部脱臼法处死大鼠。标本采集取出肺组织，10%福尔马林溶液固定，一部分进行苏木精-伊红(HE)染色以及FPR1的免疫组化(IHC)染色，镜下观察肺组织病理变化，并进行病理损伤评分；一部分匀浆提取组织上清液，ELISA法检测髓过氧化物酶(MPO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)水平；取全血，留取血浆测定淀粉酶(AMY)和脂肪酶(LIP)水平；提取血浆中游离DNA，通过RT-PCR法，检测循环血浆中线粒体DNA(mtDNA)含量；采用Westernblotting法检测各组大鼠肺组织中的甲酰肽受体1(FPR1)、甲酰肽受体2(FPR2)蛋白含量，同时采用RT-PCR法在基因水平检测FPR1、FPR2mRNA含量。 2.运用16SrDNA测序技术初步探讨清胰汤调整SAP大鼠肠道微生态菌群结构的研究 30只SPF级健康雄性Wistar大鼠，分组以及建模方法同上，标本收集各组中结肠和胰腺组织，采用苏木精-伊红(HE)染色法观察结肠和胰腺组织病理变化，同时收集大鼠盲肠段粪便，16SrDNA测序技术分析各组大鼠肠道微生物菌群的变化。 结果： 1.清胰汤调控DAMPs对SAP-ALI大鼠肺组织器官损伤治疗机制的研究 1.1肺组织HE染色比较：与对照组相比，模型组肺组织有明显肺血肿、肺淤血表现，大部分肺泡间隔明显增宽，肺泡腔部分融合成肺大泡，肺泡中大量PMN、巨噬细胞浸润(P＜0.01)，而清胰汤组炎症反应明显减轻(P＜0.05)。 1.2肺组织中MPO、TNFα、IL-1及IL-6水平测定：较对照组相比，模型组中MPO、TNFα、IL-1及IL-6水平显著升高(P＜0.01)，但是清胰汤治疗组显著降低这些指标(P＜0.01)。 1.3血浆AMY和LIP测定：较对照组相比，模型组中AMY和LIP水平显著升高(P＜0.01)，但是清胰汤治疗组显著降低这些指标(P＜0.01)。 1.4血浆mtDNA的荧光定量PCR检测:较对照组相比，模型组中大鼠循环血中mtDNA水平显著升高(P＜0.01)，但是清胰汤组可显著下调血浆中mtDNA含量(P＜0.01)。 1.5肺组织中FPR1IHC染色比较：通过各组光密度值可知，与对照组相比，模型组大鼠肺组织中可见明显的肺泡水肿，大量的中性粒细胞浸润等病理表现(P＜0.001)；而清胰汤组炎细胞浸润、肺泡水肿程度较模型组降低(P＜0.05)。 1.6肺组织中FPR1、FPR2mRNA及蛋白表达比较：模型组肺组织中FPR1、FPR2mRNA和蛋白相对表达量高于对照组(P＜0.01)，清胰汤组肺组织中FPR1、FPR2mRNA和蛋白相对表达量低于模型组(P＜0.01)。 2.运用16SrDNA测序技术初步探讨清胰汤调整SAP大鼠肠道微生态菌群结构的研究 2.1各组肠、胰腺组织的病理学评分比较 从病理结果中显示，模型组中肠组织表现为肠壁水肿，肠黏膜上皮缺损、脱落等，上皮下间质空隙变宽，大量PMN等炎性细胞浸润等；胰腺组织表现为胰腺腺泡水肿、坏死，小叶间隔增宽，大量PMN等炎性细胞浸润等(P＜0.05)，而中药清胰汤可减轻模型组中的胰腺损伤和肠黏膜受损程度(P＜0.05)。表明本实验的大鼠重症急性胰腺炎造模成功，清胰汤对SAP的胰腺实质损伤以及肠道的黏膜损伤有一定的修复以及保护作用。 2.2各组粪便中肠道菌群多样性分析 三者之间物种差异性比较具有统计学意义(P＜0.05)。测序的样本量足够大，具有一定程度的代表性，基本可以反应出测序的绝大多数菌群物种的生物信息，且所测同组中样本组成的均匀度相似。 2.3肠道菌群结构分析：从门、纲、属三个水平分析结果显示清胰汤组可有效降低SAP大鼠厚壁菌门含量，其中包括梭菌纲(优杆菌属)和芽孢杆菌纲(梭状芽孢杆菌属)，以及毛螺菌属数量菌群含量下降，升高拟杆菌门(包括拟杆菌纲、拟杆菌属)和乳酸杆菌属含量(均P＜0.05)。 结论： 1.SAP大鼠血浆中mtDNA水平升高，而中药清胰汤灌胃可有效降低SAP大鼠循环血中mtDNA水平，起到对机体器官保护作用，且SAP大鼠循环血中mtDNA也许可作为一种判断SAP受损严重程度的指标。 2.中药清胰汤灌胃可通过活化SAP-ALI中肺组织各种炎性细胞表面的FPR1和FPR2的表达，起到对SAP-ALI中肺组织过度炎症反应的保护作用。 3.中药清胰汤可增加SAP大鼠的肠道菌群的多样性和丰富性，调控微生物生态平衡，增加益生菌群的含量，降低有害菌群的定植能力，从而达到对肠道的保护作用。
重症急性胰腺炎;清胰汤;线粒体DNA;甲酰肽受体;肠道微生态
天津医科大学
硕士
中西医结合
刘洪斌
2019
中文
R285.5;R576
2020-07-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）