构巢曲霉中调控胞质分裂和无性产孢的重要蛋白PomA、PaxB和AcnA的功能研究
细胞分裂(cell division)是细胞生命活动的重要特征之一，主要包括细胞核分裂和胞质分裂(cytokinesis)两步。胞质分裂作为细胞分裂的最后一步，将一个母细胞分裂成两个子细胞。在哺乳动物细胞中，异常的胞质分裂可能会导致一系列疾病，甚至机体死亡。在酵母细胞中，异常的胞质分裂会导致形成无核或者多核的细胞。在丝状真菌中，胞质分裂对于产孢、产隔和菌丝生长都有十分重要的作用。 胞质分裂主要是由肌动蛋白收缩环(contractile actin ring，CAR)收缩拉着细胞膜内陷使细胞缢裂成两个子细胞，在真菌细胞中还伴随着隔膜的形成。这一过程大致可以分为四步：选择分裂位点、肌动蛋白收缩环的组装、肌动蛋白收缩环收缩以及收缩完成后的去组装。前期研究发现，在模式丝状真菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中存在一条由一系列保守激酶组成的隔膜形成开始网络(Septation Initiation Network, SIN)正向调控胞质分裂过程。其中SepH是SIN信号途径中的核心组分，对胞质分裂和无性产孢起着十分重要的作用。研究发现，当SepH缺失时菌丝胞质分裂缺陷、不产隔膜和无性孢子，当过表达SepH时菌丝过度产隔。但是目前关于胞质分裂调控的研究仍然不够清楚，人们对于胞质分裂的调控机制知之甚少。sepH1是一株温度敏感型突变株，在限制性温度42℃培养时SepH失活。本实验室前期通过紫外诱变得到116株产隔和产孢恢复的突变菌株，表明存在其它调控因子参与胞质分裂的调控。因此，本研究以丝状模式真菌构巢曲霉为研究材料，基于以上突变体库筛选新的胞质分裂调控因子并对其调控机制展开研究，主要得到以下结论： 1、蛋白激酶PomA是sepH1的反向调节子。首先，用正向遗传学的方法寻找sepH1的反向调节子。通过菌落表型分析和显微镜观察筛选出产隔与产孢恢复的菌株，通过曲霉杂交验证突变菌株为非sepH回复突变。用二代测序技术和SNP分析发现突变株中蛋白激酶PomA的活性位点发生突变。接下来，用反向遗传学的方法进行验证，构建sepH1和pomA双突变菌株，菌落表型分析以及显微镜观察显示sepH1和pomA双突变菌株相较于sepH1单突变菌株产隔与产孢都有恢复，表明PomA是sepH1的反向调节子。 2、PomA通过负调控MAPK途径的活性反向调节SepH。定量磷酸化蛋白质组学显示敲除PomA后MAPK途径活性升高。Westernblot显示，与野生型对比sepH1中MAPK活性明显降低，而PomA突变菌株中MAPK活性升高，表明SepH是MAPK途径的正调节子，而PomA是负调节子。通过显微镜观察，盐逆境激活MAPK途径也能恢复sepH1隔膜与孢子的产生。表明PomA通过和SepH协同调控MAPK途径活性进而反向调节SepH。 3、Paxillin蛋白PaxB参与调控产隔与产孢。通过生物信息学分析，构巢曲霉中包含两个paxillin蛋白PaxA和PaxB。敲除PaxB后，菌落不产孢子，菌丝细胞不产隔膜，表明PaxB参与产隔与产孢的调控。 4、AcnA和PaxB通过调控Actin环在分裂位点的组装而参与调控胞质分裂。通过GFP荧光标记和荧光显微镜观察，在AcnA和PaxB敲除菌株中，Actin不能在分裂位点组装成环状结构而造成胞质分裂缺陷。表明AcnA和PaxB是Actin环组装所必须的。 综上所述，本文发现一个负向调节子PomA和两个正向调节子AcnA和PaxB参与调控构巢曲霉的胞质分裂，并阐明了它们的调控机制，丰富和完善了胞质分裂调控网络，对细胞的胞质分裂活动有了新的认识。
构巢曲霉;胞质分裂;无性产孢;PomA蛋白;PaxB蛋白;AcnA蛋白
南京师范大学
博士
生物学;微生物学
陆玲
2019
中文
Q253
2020-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）