寡核苷酸重组工程和CRISPR-Cas9联合介导的恶臭假单胞菌KT2440基因组编辑
重组工程也叫λ-Red/ET同源重组技术，它是一种基于?噬菌体来源的重组酶催化DNA之间的同源重组而实现基因克隆与修饰的的一种基因工程操作手段。该技术实验过程操作简单，不需要克隆操作，不受到制性内切酶酶切位点以及DNA分子大小的限制，可以实现对基因组精确修饰的目的。而单链寡核苷酸重组工程技术可以在基因组上实现多个位点的同步编辑，相比于传统的重组工程更加简便和快捷。 CRISPR-Cas系统（成簇规律间隔的短回文重复序列和CRISPR相关蛋白）属于细菌与古细菌在长期进化演变过程中形成的一种可以针对噬菌体的感染、质粒接合以及转化等基因导入而形成特异性的防御机制。目前，Ⅱ型CRISPR-Cas9系统是研究的主要焦点，也是最广泛使用的基因编辑系统。该技术在基因组改造方面具有很高的编辑效率以及可编程性，现在已经成为一种在实验室中被广泛使用的基因编辑工具。 恶臭假单胞菌KT2440（PseudomonasputidaKT2440）是一种最具特征性的革兰氏阴性假单胞菌，已经越来越成为有价值的化合物异源表达宿主菌。而且恶臭假单胞菌KT2440具有净化环境的作用，可以降解环境中的一些有机物，在生物技术方面具有潜在的应用研究价值，被称为极具开发潜能的一大类环境益生菌。本研究探索了单链寡核苷酸重组工程和CRISPR-Cas9相结合的基因组编辑手段。 首先，我们基于单链寡核苷酸重组工程介导的mkan基因修复为卡那霉素抗性基因kan的效率比较而筛选出最佳重组酶基因redβ。然后构建寡核苷酸重组工程和CRISPR-Cas9表达质粒pLS3819，并转移至mkan基因组整合菌株。基于单链寡核苷酸重组工程和CRISPR-Cas9结合介导的mkan片段修复kan的效率比较，测试了不同的启动子驱动的sgRNA，发现Pm启动子效率最佳。 其次，利用寡核苷酸重组工程和CRISPR-Cas9对P.putidaKT2440内源基因进行编辑。成功实现了P.putidaKT2440基因组上的pheS和upp两个基因的点突变，其点突变的效率分别为75%和100%，也对upp，PP_0589，PP_3548和PP_2064–PP_2069（分别为621bp，1164bp，1518bp和9293bp）基因片段进行敲除，其敲除的效率分别为100%、85%、70%和3%，基因编辑的效率随着敲除片段长度的增加而有所下降,但仍可较为简便地获得突变株。所建立的基因编辑方法具有高效率和简便快捷等优点。 最后，构建了一系列含有报告基因lacZ基因的质粒和菌株，以确定基于dCas9的CRISPRi（CRISPRinterference）系统。然而发现LacZ的酶活水平太低而不适用于该CRISPRi系统测定，未来的研究将继续改进CRISPRi系统。
重组工程;恶臭假单胞菌;CRISPR-Cas9;基因组编辑;寡核苷酸
南京师范大学
硕士
生物学
尚广东
2019
中文
Q344.12
2020-04-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）