粟酒裂殖酵母Ppr10-Mpa1复合体的制备
线粒体作为一种具有双层膜结构且能独立复制的细胞器，是细胞内合成ATP的主要场所。在粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe,S.pombe）中，线粒体基因组（mtDNA）的表达对线粒体功能的发挥至关重要。mtDNA主要编码氧化磷酸化复合物的7个关键亚基，线粒体蛋白合成所需要的两个核糖体亚基和25种tRNA以及RNaseP的RNA亚基（rnpB）。 PPR蛋白含有2-30个PPR模体，该结构由简并的35个串联重复的氨基酸组成，可与RNA结合。在人和小鼠、植物和芽殖酵母等物种中，PPR蛋白参与了mtDNA编码的基因表达的转录和转录后调控。PPR蛋白与RNA特异结合，与RNA5′端成熟、内含子剪切、RNA编辑和稳定等密切相关。我们实验室报道Ppr10可以免疫共沉淀出Mpa1，以及Ppr10和Mpa1参与了线粒体蛋白质的翻译。但是不清楚Ppr10和Mpa1形成复合体的生理意义。本文针对上述问题开展了研究。首先利用双分子荧光互补（bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC）方法检测Ppr10和Mpa1在活细胞内的相互作用，Westernblotting和荧光显微镜观察实验结果表明Ppr10与Mpa1在体内存在直接相互作用。另一方面，体外研究Ppr10和Mpa1相互作用的意义的关键是获得Ppr10-Mpa1复合体和Ppr10。本文利用粟酒裂殖酵母ESP?表达系统表达了Ppr10-Mpa1复合体和Ppr10。为得到Ppr10-Mpa1复合体，利用ESP?表达系统将ppr10和mpa1克隆到pESP2质粒上，实现蛋白Ppr10和Mpa1在粟酒裂殖酵母中共表达。利用FastPrep-24仪器和GST亲和层析柱纯化得到Ppr10-Mpa1复合体，复合体基本达到体外研究对于蛋白纯度的要求。作为对照实验，利用同样的方法在粟酒裂殖酵母中表达Ppr10并纯化GST-Ppr10。本文研究为后续体外研究Ppr10和Mpa1相互作用的生理意义，如利用荧光热稳定性方法检测Mpa1是否促进Ppr10的稳定性打下了基础。 粟酒裂殖酵母Atp4被预测为线粒体ATP合酶F0的组成蛋白，但是具体功能并不清楚。本文通过表型研究发现atp4敲除后菌株出现生长缺陷，荧光显微镜观察发现atp4定位于线粒体内。Atp4的缺失导致线粒体基因组编码的蛋白Cob1、Cox1、Cox2和Atp6表达水平急剧下降。以上研究说明atp4对线粒体蛋白表达量的稳定很重要。
粟酒裂殖酵母;Ppr10-Mpa1复合体;线粒体基因;RNA亚基
南京师范大学
硕士
生物学
黄鹰
2019
中文
Q949.326.1
2020-04-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）