克氏原螯虾三个免疫相关基因Caspase-3C、Lectin和LGBP的功能研究
克氏原螯虾（Procambarusclarkii），俗称小龙虾、红螯虾等，其食性杂、生长快且适应力极强，自上世纪三十年代传入我国，因肉质鲜美而深受人们喜爱，之后快速占据淡水虾类经济产业的重要地位，现已成为世界上商品价值最大的虾类之一。十几年前南京的“龙虾门”事件，使人们对克氏原螯虾的病害情况开始有了重视，也吸引了越来越多的科研人士着手研究其染病、抗病等内容。另外，随着人们对克氏原螯虾的热情进一步高涨，供不应求的情况时有发生，这就迫使养殖户更大规模地进行养殖，随之而来的也是克氏原螯虾患病几率的增加及感染病原体的多样；而克氏原螯虾同其他无脊椎动物一样，仅依靠先天免疫来防御病原入侵，因此对克氏原螯虾先天免疫的研究更显得尤为重要。本课题研究了Caspase-3C、Lectin和LGBP三种重要的免疫基因在克氏原螯虾体内的免疫功能，并得到以下结果： 1、在克氏原螯虾体内克隆到一种半胱氨酸蛋白酶基因，命名为PcCaspase-3C，该基因全长4684bp，其包含一个1572bp的开放阅读框（ORF），编码523个氨基酸。该蛋白含有一个由237个氨基酸组成的CASc结构域和一个低复杂度区域。该基因主要表达于心脏、胃和肠道，在肝胰腺和鳃中表达量较低，在血细胞中表达最少。受金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌或白斑综合征病毒（WSSV）刺激后，PcCaspase-3C在肠、胃中的表达水平均有不同程度的上调。将该基因干扰后，再用副溶血弧菌刺激克氏原螯虾，发现有部分抗菌肽的表达被抑制，如ALF2、ALF5、ALF6、Cru4和Lys。将该基因敲低后，用WSSV感染克氏原螯虾，WSSV的拷贝数有明显增加。根据以上结果，推测PcCaspase-3C在克氏原螯虾抗细菌和抗病毒免疫应答中发挥重要作用。 2、C型凝集素作为一类模式识别受体（PRRs）在甲壳动物的先天免疫中发挥重要作用。在本研究中，我们在克氏原螯虾中发现了一种新的凝集素基因（PcLectin），该基因全长1025bp，包括528bp的ORF，编码175个氨基酸的蛋白。PcLectin蛋白含有一个信号肽和一个糖识别结构域（CRD）。该基因在胃中表达水平最高，在肝胰腺中表达较少，在其他组织中几乎不表达。在感染金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌或WSSV的虾中，PcLectin的表达均出现不同程度的上调。将该基因敲低后，用副溶血弧菌刺激克氏原螯虾，部分抗菌肽的表达被抑制（ALF2、ALF6、Cru2、Cru4）。将该基因进行体外原核重组表达，发现重组表达的蛋白对几种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和多糖均具有结合活性，且能以Ca2+依赖的方式凝集细菌。综合以上结果，我们认为，PcLectin参与了克氏原螯虾先天免疫防御。 3、脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白（LGBP）作为一种模式识别受体，参与无脊椎动物先天免疫。本研究中，我们在克氏原螯虾体内克隆到一个LGBP基因，全长1327bp，包括1113bp的ORF，编码由370个氨基酸残基组成的蛋白质，其含一个信号肽、一个糖苷水解酶活性结构域（Glyco_hydro_16）和一个低复杂度区域。经过研究，发现该基因在不同组织中的表达存在性别差异，在健康的克氏原螯虾体内，在雌虾各种组织中的表达量几乎都低于雄虾。无论是雌虾还是雄虾，都是在肝胰腺中表达最高，其他组织中表达较少，肠道中表达最少。经副溶血弧菌或脂多糖（LPS）刺激后，该基因在雌体和雄体中的变化情况亦有差异，但在胃和肝胰腺中的表达整体呈上升趋势。在雄虾的肝胰腺中，将PcLGBP基因敲低后，多种抗菌肽基因的表达都受到抑制。体外重组表达的LGBP蛋白（rPcLGBP），对LPS、Glu和PGN都有不同程度的结合活性，并且可以结合多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。酚氧化酶活性测定实验结果表明，在正常雄虾的肝胰腺、鳃和胃中，其酚氧化酶活性均显著高于雌虾。在雄虾肝胰腺中，将PcLGBP敲低后，酚氧化酶活性降低。重组的LGBP蛋白和β-1,3-葡聚糖（Glu）或LPS孵育后可以明显提高肝胰腺的酚氧化酶活性。以上结果表明LGBP不仅可以参与抗菌肽基因的表达调控，还可以参与酚氧化酶的活化；在雄虾体内，其表达水平较高，赋予雄虾较高的酚氧化酶活性。
克氏原螯虾;先天免疫;Caspase基因;Lectin基因;LGBP基因;酚氧化酶;抗菌肽
南京师范大学
硕士
水产
任乾
2019
中文
S945.4
2020-04-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）