EGCG对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的生长抑制及凋亡诱导作用的研究
本研究采用细胞培养、CCK-8、细胞划痕、Transwell、RT-PCR、细胞周期、JC-1、DAPI染色、AV/PI、Westernblot分析、裸鼠皮下移植瘤等细胞和分子生物学技术，主要以HepG2和SMMC-7721两种人源肝癌细胞系为实验对象，研究了EGCG对其增殖、迁移、细胞周期、线粒体膜电位与凋亡的影响。结果如下： 1EGCG抑制细胞增殖与迁移 为了确定EGCG对HCC细胞的影响，用0、1、5、10、20、50、100、150、200μMEGCG分别处理包括HepG2、SMMC-7221和LO2在内的三种肝细胞系24h和48h之后使用CCK-8评估细胞增殖抑制率。随着药物浓度的增加，两种癌细胞增殖能力显著降低，而正常肝细胞的活力并未有明显影响。之后我们还通过使用细胞划痕（0、50、100μM）和Transwell测定来测量EGCG（0、50、100、150、200μM）对HepG2和SMMC-7721细胞迁移的影响。 Transwell结果显示与对照组相比，EGCG处理组中两种细胞系的迁移强度显著减弱。RT-PCR结果显示，两种细胞系中MMP-2和MMP-9的RNA表达水平显著降低（P＜0.05）。结果显示：EGCG降低HepG2和SMMC-7721细胞的细胞活力，抑制增殖，而EGCG对LO2细胞的细胞活力的影响较小；EGCG抑制HepG2和SMMC-7721细胞的迁移。提示：EGCG可以抑制细胞增殖与迁移。 2EGCG诱导细胞周期阻滞 为了阐明EGCG诱导的细胞生长抑制是否通过细胞周期进展的改变介导，用0、50、100、150、200μMEGCG分别处理包括HepG2细胞和SMMC-7221细胞24h。之后我们通过细胞周期染色缓冲液（CellcyclestainingBuffer）染色后在一小时内使用流式细胞仪测定细胞周期分布。并使用Westernblot分析相关蛋白的表达情况。结果显示：EGCG在HepG2和SMMC-7721细胞中引起S期的显著停滞；Westernblot结果显示，与对照组相比，实验组的两种细胞系中CyclinD1、CyclinE、p27、p21蛋白表达水平均升高，而CyclinA蛋白表达水平降低。提示：EGCG诱导细胞周期阻滞于S期。 3EGCG导致细胞线粒体膜电位降低并诱导细胞凋亡 为了验证EGCG是否可以与肝癌细胞的凋亡有关，用不同浓度EGCG分别处理两种细胞24h。之后分别使用JC-1、DAPI、AV/PI双染法测定了加药处理后细胞状态的改变，并使用Westernblot分析相关蛋白的表达情况。结果显示：当HepG2和SMMC-7721细胞暴露于EGCG时，线粒体膜电位（ΔΨm）显著降低；使用DAPI染色检测出具有核碎裂和缩合的细胞（细胞凋亡的标志）；双染法流式细胞术结果显示随着加药浓度增高肝癌细胞的凋亡率（早凋、晚凋、坏死）增加；处理后Bax蛋白的表达显著增加，Bcl-2蛋白的表达则被下调；凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的剪切活化形式的表达也被上调。提示：EGCG在两种肝癌细胞中可降低ΔΨm并诱导凋亡相关蛋白质的差异表达，最终导致细胞凋亡。 4EGCG抑制裸鼠皮下移植瘤的生长 选取20只4～6周的雌性裸鼠，体重为14～16g。将培养的人源肝癌细胞HepG2的数量调整至1×107个/mL，用无血清的培养基重悬细胞注射入裸鼠后腿侧。当小鼠皮下肿瘤的大小大概增殖至80-100mm3时，给携带肿瘤的小鼠皮下注射EGCG（10、20、40mg/kg）和生理盐水作为对照，隔天给药共5次。每天观察肿瘤生长状况并称量体重。实验完成后处死小鼠剥离瘤块，测量并称重。结果显示：给药组与对照组相比，肿瘤增殖速度减慢，瘤重差异明显。提示：EGCG可抑制裸鼠移植瘤的生长。
肝癌;EGCG;HepG2;SMMC-7721;细胞凋亡
南京师范大学
硕士
生物学
毛伟平
2019
中文
R735.7
2020-04-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）