Tca-miR-375-3p及其靶标Ptdlns-P2-Ptase调控赤拟谷盗羽化和生殖的功能研究
昆虫的变态发育是昆虫与环境长期适应、协同进化的结果，受激素、营养和基因的精确调控，在此过程中有多重因子协同发挥作用。近年来，非编码小分子RNA（microRNA）在昆虫中的研究表明，其对昆虫的变态发育具有显著的调控作用。但在模式昆虫赤拟谷盗中，对microRNA参与发育事件的研究仍鲜有报道，对其具体的调控机制也需要进一步阐明。本论文中利用miRNA类似物、双荧光素酶报告实验、双链干扰以及解剖学观察等实验手段对miR-375-3p及其靶基因Ptdlns-P2-Ptase进行了功能分析，并对其在赤拟谷盗中的作用机制有了一个初步探讨。 首先，通过注射miR-375-3p类似物上调其表达进而探讨其在蛹到成虫的调控作用。miR-375-3p类似物处理组跟对照组比，处理晚期蛹组阻碍了蛹到成虫的发育过程，并引起致死效应，顺利羽化为成虫后也存在羽化缺陷；顺利进入成虫期后发现，与对照组相比，成虫产卵量下降，且解剖后发现卵巢发育有缺陷，卵巢管受精卵的数量明显少于对照组。 其次，为研究miR-375-3p对赤拟谷盗的变态发育过程中羽化和生殖的调控，使用3个预测软件PicTar，miRanda，Targetscan对miR-375-3p进行靶基因预测，分别得到的结果中选取交集，且按匹配值以及种子序列及结合前期候选靶基因功能研究，最终筛选出3个预测靶基因，它们分别为：Eip63E,Pkn,Ptdlns-P2-Ptase。随即对候选靶基因构建荧光素酶报告基因载体，进行体外验证，结果表明Ptdlns-P2-Ptase是miR-375-3p真正的靶基因，跟对照组相比，只有Ptdlns-P2-Ptase的荧光素酶活性下降70%左右。 最后，为了进一步探讨miR-375-3p和其靶基因Ptdlns-P2-Ptase对赤拟谷盗发育的调控作用，我们对其靶基因的体内功能进行研究。在晚期蛹进行Ptdlns-P2-PtaseRNAi，显示了与注射miR-375-3p类似物后相似的生物学表型，尽管Ptdlns-P2-Ptase的敲减对赤拟谷盗变态发育的影响更为显著。这些结果进一步证明了Ptdlns-P2-Ptase是miR-375-3p的靶基因。 与此同时，我们发现注射miR-375-3p类似物和敲减Ptdlns-P2-Ptase时，蜕皮激素通路上的关键基因Br-c，E74，EcR，E93的表达量与对照组相比没有显著差异；与此相对的是，保幼激素通路上的转录因子Kr-h1的表达量明显升高。这些结果表明miR-375-3p和Ptdlns-P2-Ptase都参与调控赤拟谷盗保幼激素通路，从而影响羽化和生殖。 综上所述，作为赤拟谷盗在晚期蛹低表达，早期成虫特异高表达的miRNA之一，miR-375-3p调控蛹的正常发育，并参与了赤拟谷盗变态发育中的羽化和生殖过程，证明了时期特异性miRNAs存在潜在的生物学意义。此外，miR-375-3p通过其靶基因Ptdlns-P2-Ptase影响双信使信号通路对保幼激素信号分子的传递效率，从而参与调控赤拟谷盗羽化和生殖过程。
赤拟谷盗;羽化生殖;miR-375-3p;Ptdlns-P2-Ptase;双信使信号通路
南京师范大学
硕士
生物学;动物学
李斌
2019
中文
Q965
2020-04-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）