竹黄Shiraiabambusicola发酵优化及两种苝醌代谢产物的光动力抗肿瘤活性
竹黄Shiraiabambusicola是一种珍稀的药用真菌，仅分布于中国长江以南地区和日本。竹红菌素类化合物为竹黄的主要药用活性成分，其中以竹红菌素A（hypocrellinA，HA）含量最高，研究最为广泛。近年来，有学者在竹黄菌株代谢产物中检测到痂囊腔菌素A（elsinochromeA，EA）。在此之前，EA主要来源于痂囊腔菌属真菌的发酵培养。但由于痂囊腔菌属真菌生长缓慢，限制了EA的积累。HA和EA是天然的优良光敏剂，可用于光动力疗法（photodynamictherapy，PDT）治疗多种疾病，尤其是肿瘤治疗。但由于资源匮乏的限制，两种光敏剂的PDT应用发展仍不理想。 竹黄的野生资源日渐枯竭，促使了竹黄菌株的开发利用。本研究中，通过形态特征和系统发育分析，鉴定分离菌株ZH42为竹黄。从竹黄ZH42中纯化得到两个苝醌化合物，经鉴定为HA和EA。通过高效液相分析方法建立了HA标准曲线（y=19.59x+52.99）和EA（y=31.37x-265.06）标准曲线。竹黄ZH42在固体发酵条件下，HA产量为275.34μg/g，EA产量为491.50μg/g。竹黄ZH42在液体发酵条件下，HA的产量为103.51mg/L，EA产量72.09mg/L。采用单因子实验对竹黄ZH42液体发酵培养条件（温度、摇床转速和初始pH）和培养基组分（碳源、氮源和生长因子）进行优化。随后，选用Box-Behnkendesign对培养基组分浓度进一步优化。优化得到的参数如下：温度28℃，摇床转速180rpm，初始pH6.5，葡萄糖24g/L，氯化铵2.2g/L，马铃薯浸汁260g/L。在优化的条件下，HA和EA产量分别为365.14和340.85mg/L，相比初始产量分别提高3.52倍和4.73倍。 PDT是一种新型的治疗方法，在氧气的存在下，通过光激活光敏剂产生过量活性氧诱导细胞死亡。但是许多光敏剂的水溶性差且没有特异的组织分布，如HA。光敏剂的这些特征成为它们PDT应用过程的主要障碍。癌细胞表面过量表达的转铁蛋白受体可以用于实现位点特异的药物靶向递送。在本研究中，我们成功的合成了转铁蛋白修饰的聚乳酸-羟基乙酸和羧甲基壳聚糖靶向纳米粒，用于装载HA，命名为TF-HA-CMC-PLGANPs。表征了TF-HA-CMC-PLGANPs的形态、粒径分布、红外光谱、包封率和载药量。在体外实验中，TF-HA-CMC-PLGANPs表现出对A549细胞（转铁蛋白受体阳性细胞）的靶向能力，比没有转铁蛋白修饰的HA-CMC-PLGANPs具有更高的细胞毒性、细胞摄取、ROS生成和细胞凋亡率。利用雄性A549荷瘤裸鼠模型进行体内PDT效果的研究。为期15d的治疗中，TF-HA-CMC-PLGANPs处理组小鼠肿瘤生长抑制率达到63%。TF-HA-CMC-PLGANPs更多的积累在肠道和肿瘤部位，其余正常组织中的药物被快速代谢。TF-HA-CMC-PLGANPs处理组小鼠肿瘤组织有大量的细胞损伤现象。 EA具有较高的单线态产氧产率。然而，关于EA对不同类型癌细胞的PDT效果研究尚少，尤其是对多药耐药细胞的作用。测定EA的单线态氧产生曲线，表明15min是最合适的光照时间。检测EA的光动力抗肿瘤活性，结果表明EA对几种细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为9.62（HeLa）、15.51（A549）、21.20（MDA-MB-231）、22.95（HepG2）和51.75μg/L（A549/Taxol）。在1mg/L的多柔比星或紫杉醇处理下，A549/Taxol细胞的存活率仍高达90%以上，这是由于A549/Taxol细胞产生了多药耐药性。流式细胞术分析凋亡结果同样证明EA能够明显的诱导A549细胞、HepG2细胞和A549/Taxol细胞凋亡。为了深入研究EA的光动力抗肿瘤活性，我们制备了两种不同的纳米粒，即双亲性壳聚糖EA纳米粒和正电荷的TPGS&PEI-PLGA&PLGA&EA纳米粒，为EA的进一步研究提供药物递送载体。 总之，竹黄ZH42将提供HA和EA，用于PDT应用研究。我们构建的位点特异药物靶向递送系统能够使药物更多的积累，增加抗肿瘤效应。此外，EA有潜力克服癌细胞的多药耐药。
竹黄;Shiraiabambusicola发酵;苝醌代谢产物;光动力性能;抗肿瘤活性
南京师范大学
博士
生物学;微生物学
陈双林
2019
中文
S567.39
2020-04-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）