五没食子酰基葡萄糖对人胰腺癌细胞和携瘤鼠恶病质的治疗作用
研究目的： 胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤，其恶性程度较高，是最致命的恶性肿瘤之一。由于胰腺癌早期诊断困难，手术切除率低，加之晚期胰腺癌对非手术的治疗手段反应较差，导致胰腺癌5年生存率不足1%。胰腺癌细胞主要通过对细胞内葡萄糖进行酵解而提供能量，在此过程中胰岛素和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）发挥了重要作用。胰岛素和IGF-1不但与自己的受体，即IR和IGF1R，特异地相结合，还可以与彼此的受体交叉结合，从而促进胰腺癌细胞的生长。干扰胰岛素及其受体下游信号通路有可能对胰腺癌的发生发展起到调控作用。由于肿瘤细胞生长迅速，故瘤内常常处于相对缺氧状态，所以胰腺癌细胞可表达缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）并形成HIF-1。当肿瘤细胞高表达HIF-1α时，还可以激活下游的小窝蛋白（cav-1），使细胞的生长、糖酵解以及肿瘤的血管生成都会增加，这些因素都可以支持肿瘤细胞的快速生长。故HIF-1也是调节胰腺癌发生发展的一个重要靶点。此外，胰腺癌细胞即使在氧气充足的情况下依然会出现激活糖酵解关键酶（如：HK-II和PFK-1）使糖酵解活性增强的现象，即“瓦博格效应”。瓦博格效应除了可以给肿瘤细胞供能，还能够促进肝脏糖异生（糖异生关键酶PCB和G-6-Pase活性增加）、刺激骨骼肌蛋白水解（代表肌肉降解的标志物Atrogin-1和MuRF-1高表达）以及促进脂肪组织的脂解（脂解关键酶ATGL活性增强），最终因体重减轻、机体负氮平衡而导致癌恶病质的发生。抑制肿瘤细胞的瓦博格效应是治疗胰腺癌恶病质的潜在靶点。五没食子酰基葡萄糖（PGG）是一种存在于植物中的天然多酚化合物，PGG也是IR的配体，能够与IR/IGF1R结合，对细胞中葡萄糖的代谢起到重要的调节作用。PGG被证明在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和肝癌等诸多恶性肿瘤的治疗中均可发挥一定的抑制作用，其机制包括调节肿瘤细胞的细胞周期、调节HIF-1α的表达、调整细胞整体的营养代谢等途径。本研究的目的是探究β-PGG能否在胰腺癌细胞中通过抑制IR/IGF1R活性和HIF-1α的表达水平从而抑制该细胞的瓦博格效应并缓解胰腺癌荷瘤鼠的恶病质状态。 研究方法： 第一部分：1）应用胰腺癌细胞系MiaPaCa-2作为研究对象，使用不同浓度胰岛素（100pM-1?M）刺激该细胞，在常氧和缺氧（1%氧）两种条件下进行实验。使用Westernblot等方法检测常氧、缺氧条件下胰腺癌细胞IR和IGF1R的磷酸化程度、下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2信号通路的激活情况、HIF-1α和cav-1的变化情况及细胞糖酵解通路的关键酶HK-II和PFK-1等指标，观察胰岛素对胰腺癌细胞的刺激作用。2）使用β-PGG（5、13、25、50?M）作用于MiaPaCa-2和PANC-1细胞，使用Westernblot方法在常氧和缺氧两种条件下检测细胞中IR、IGF1R、Akt和ERK的磷酸化水平、HIF-1α和cav-1表达水平及细胞糖酵解通路的活性（HK-II和PFK-1）等指标，观察β-PGG对上述信号通路的作用机制。3）使用β-PGG（25和50?M）作用于MiaPaCa-2细胞，随后使用MTT实验和集落形成实验检测了细胞短期和长期的增殖能力，使用迁移实验和划痕实验检测了细胞的迁移能力，观察β-PGG对胰腺癌细胞表型的影响。 第二部分：用MiaPaCa-2细胞建立胰腺癌荷瘤鼠动物模型，40只裸鼠随机分为四组，每组10只，分别为对照组（intactathymicmice，I组），荷瘤组（untreatedtumorcarriers，U组）、PGG荷瘤给药组（treatedwithβ-PGG，P组）、大黄酸荷瘤给药组（treatedwithrhein，R组，作为阳性对照药物组）。除对照组外，其余三组的实验动物均在麻醉后采用二次成瘤的方法，在一侧腋窝皮下植入由MiaPaCa2细胞生成的肿瘤组织块（2mm3），饲养1周后移植瘤生长良好，荷瘤鼠已经有明显的成瘤后开始给药治疗。P组携瘤鼠经灌胃给予β-PGG20mg/kg每日一次，R组给予大黄酸100mg/kg每日一次，U组给予等体积的PBS每日一次，I组不处理。每周测量肿瘤的大小和记录体重。给药8周后，经麻醉将动物处死取材。利用肿瘤形态测量、组织学染色、血浆生化指标检测、骨骼肌、脂肪、肝脏代谢状态分析等研究方法，研究β-PGG的抗肿瘤能力及其对胰腺癌荷瘤鼠能量平衡的影响，分析肿瘤组织中IR和IGF1R的磷酸化程度、下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2信号通路的激活情况、HIF-1α和cav-1的变化情况及细胞糖酵解通路的活性（HK-II和PFK-1）等。同时还将观察β-PGG对肝脏中PCB和G-6-Pase的水平的影响、对骨骼肌中Atrogin-1和MuRF-1的水平的影响、对脂肪中ATGL的水平的影响来评价荷瘤鼠恶病质严重程度的改善情况。 研究结果： 体外实验研究结果： 1)胰岛素作用于MiaPaCa-2细胞时，可以升高IR/IGF1R的磷酸化程度、激活下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2两条信号通路、上调HIF-1α和cav-1的表达、增强细胞糖酵解关键酶HK-II和PFK-1的活性。 2)β-PGG能够降低MiaPaCa-2细胞和PANC-1细胞中IR/IGF1R的磷酸化程度、抑制下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2两条信号通路的激活、抑制HIF-1α和cav-1的表达、降低细胞糖酵解关键酶HK-II和PFK-1的活性。在细胞表型方面能够明显抑制MiaPaCa-2细胞的增殖和迁移能力。 体内实验研究结果： 3)β-PGG能够显著抑制胰腺癌荷瘤鼠体内肿瘤组织中IR/IGF1R的磷酸化程度、抑制下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2两条信号通路的激活、抑制HIF-1α和cav-1的表达、降低细胞糖酵解关键酶HK-II和PFK-1的活性。还能明显缩小肿瘤的重量、体积和横截面积，促进肿瘤细胞的凋亡，明显抑制胰腺癌荷瘤鼠中瘤体的生长。 4)β-PGG还能够降低胰腺癌荷瘤鼠肝脏中PCB和G-6-Pase的水平、减低骨骼肌中Atrogin-1和MuRF-1的水平、抑制脂肪中ATGL的活性。 研究结论： 胰腺癌发生时，胰岛素可以通过激活受体的磷酸化、激活下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2两条信号通路、上调HIF-1α和cav-1的表达等途径增强细胞糖酵解的活性和瓦博格效应，在一定程度上促进了胰腺癌的发生和发展。β-PGG能够显著抑制胰腺癌细胞内胰岛素受体及其下游信号通路的活性，明显抑制HIF-1α通路的激活和显著抑制癌细胞的瓦博格效应，抑制恶病质动物体内的肝糖异生、肌肉分解和脂肪水解程度。从而抑制胰腺癌肿瘤的生长，对肿瘤恶病质状态起到缓解作用，在一定程度上延缓了胰腺癌的病理进程。
胰腺癌;恶病质;五没食子酰基葡萄糖;瓦博格效应;胰岛素;缺氧诱导因子-1α
天津医科大学
博士
中西医结合
王丰
2019
中文
R735.9
2020-04-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）