PTEN基因在小鼠黑色素瘤免疫逃逸中的作用及分子机制
目的：恶性黑色素瘤（MalignantMelanoma,MM）是一种高度恶性肿瘤，好发于皮肤，我国与东亚地区发生于口腔黏膜者也不少见。有转移率高、预后较差的特点，早期可经血液转移和淋巴转移，且发病率呈逐年上升的趋势。随着肿瘤分子免疫学的快速发展，人们逐渐认识到黑色素瘤的发生、发展与患者机体的免疫功能密切相关，黑色素瘤患者体内可形成复杂而异质性的肿瘤微环境，导致肿瘤细胞滋长。针对黑色素瘤的免疫逃逸机制的研究，对临床免疫治疗方案，对患者预后判断及疗效评价具有指导意义。 第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(Phosphataseandtensionhomologdeletedonchromosometen,PTEN)是迄今发现的第1种具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN编码的蛋白通过发挥磷酸酶作用，参与调控细胞内诸多重要的信号通路，如磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（proteinkinaseB,PKB又称AKT）信号传导通路，并通过多种途径抑制肿瘤的生长、侵袭、转移，并促进肿瘤细胞凋亡。有研究表明PTEN基因在人类多种肿瘤疾病中，包括恶性黑色素肿瘤，存在表达下调甚至缺失现象。 本研究采用CRISPR/Cas9(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeatsCRISPR-AssociatedProteins9)系统基因编辑技术敲除小鼠黑色素瘤细胞系（B16F10）的PTEN基因，并建立PTEN基因敲除的小鼠黑色素瘤模型与PTEN基因未敲除的小鼠黑色素瘤模型，观察比较两组小鼠肿瘤体积大小，比较两组小鼠脾脏中细胞毒性T淋巴细胞（CytotoxicTLymphocyte,CTL）和自然杀伤细胞（NaturalKillercell,NK）的相对数量。探讨PTEN基因失活后黑色素瘤免疫逃逸的具体作用途径；揭示PTEN基因失活在黑色素瘤免疫逃逸中的作用。 方法： 1实验材料 1.1小鼠黑色素瘤高转移细胞（B16F10）：购置于中桥新舟公司 1.2C57BL\6小鼠：购置于河北医科大学动物中心 （合格证编号11400700331927） 2研究方法 2.1采用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得敲除PTEN基因的小鼠黑色素瘤高转移细胞系。通过免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）和蛋白印迹法（WesternBlot,WB）检测PTEN蛋白的表达情况对敲除PTEN基因的小鼠黑色素瘤高转移细胞系进行鉴定。 2.2通过建立PTEN基因敲除组（PTEN-/-—B16F10组）与未敲除组（PTEN+/+—B16F10组）小鼠荷瘤模型，分析比较两组小鼠的肿瘤体积大小。采用蛋白印迹法检测两组小鼠肿瘤组织中PTEN蛋白的表达情况，对敲除PTEN基因的小鼠荷瘤模型进行鉴定。 2.3使用流式细胞术（FlowCytoMetry,FCM）检测（PTEN+/+—B16F10）组、（PTEN-/-—B16F10）组、PBS组小鼠脾脏细胞中CTL细胞与NK细胞的相对数量。 结果： 1.(PTEN-/-—B16F10)细胞DNA测序结果显示：gRNA结合的部位出现无法匹配的序列，单点缺失，峰图单一，是双敲除。免疫组化和WesternBlot检测结果均显示(PTEN-/-—B16F10)细胞中PTEN蛋白不表达； 2.WesternBlot检测（PTEN-/-—B16F10）组小鼠肿瘤组织中PTEN蛋白不表达； 3.测量（PTEN-/-—B16F10）组与（PTEN+/+—B16F10）组小鼠肿瘤体积大小结果显示：在肿瘤细胞接种的第7天，第12天，第17天，第22天（PTEN-/-—B16F10）组大于（PTEN+/+—B16F10）组，各时间段均有显著性差异（P<0.05）； 4.流式细胞术（FlowCytoMetry,FCM）检测（PTEN-/-—B16F10）组、（PTEN+/+—B16F10）组、PBS组小鼠脾脏中NK细胞相对数量结果显示：在肿瘤细胞接种的第7天，第12天，第17天，第22天（PTEN-/-—B16F10）组与（PTEN+/+—B16F10）组，各时间段均没有显著差异（P>0.05）； 5.流式细胞术检测（PTEN-/-—B16F10）组、（PTEN+/+—B16F10）组、PBS组小鼠脾脏中CTL细胞相对数量结果显示：在肿瘤细胞接种的第7天，第12天（PTEN-/-—B16F10）组低于（PTEN+/+—B16F10）组，但无显著性差异（P<0.05），在肿瘤细胞接种的第17天，第22天（PTEN-/-—B16F10）组低于（PTEN+/+—B16F10）组，有显著性差异（P<0.05）； 结论： 1.成功构建了小鼠黑色素瘤PTEN基因缺失的荷瘤模型。 2.在PTEN基因缺失的小鼠黑色素瘤中，肿瘤的生长速度明显加快。 3.在小鼠黑色素瘤中，PTEN基因缺失可导致小鼠脾脏中CTL细胞数量减少，但NK细胞数量没有明显差异。 4.在小鼠黑色素瘤中，PTEN基因缺失可导致小鼠免疫能力低下，机制是由于CTL细胞数量减少导致的。 关键词:PTEN基因，恶性黑色素瘤，CTL，免疫逃逸 显著性差异（P<0.05），在肿瘤细胞接种的第17天，第22天（PTEN-/-—B16F10）组低于（PTEN+/+—B16F10）组，有显著性差异（P<0.05）； 结论： 1.成功构建了小鼠黑色素瘤PTEN基因缺失的荷瘤模型。 2.在PTEN基因缺失的小鼠黑色素瘤中，肿瘤的生长速度明显加快。 3.在小鼠黑色素瘤中，PTEN基因缺失可导致小鼠脾脏中CTL细胞数量减少，但NK细胞数量没有明显差异。 4.在小鼠黑色素瘤中，PTEN基因缺失可导致小鼠免疫能力低下，机制是由于CTL细胞数量减少导致的。
PTEN基因;恶性黑色素瘤;免疫逃逸;分子机制
河北医科大学
硕士
口腔临床医学
董玉英;孙旭
2019
中文
R739.5
2020-01-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）