11-羰基-β-乳香酸对肺癌A549和H446细胞的抑制作用以及相关机制研究
肺癌是最常见的癌症之一，也是癌症相关死亡的主要原因，全球估计每年死亡人数约为150万。约90%的癌症死亡是转移的结果，而不是原发性肿瘤。由于局部侵袭或远处转移，多数肺癌患者在晚期阶段被确诊时，已经超出手术或放射治疗的可能性。越来越多的研究发现天然产物是抗肿瘤化学品的重要来源，已经有许多体外和体内研究证明了乳香酸的抗癌特性，包含(α，β，γ)乳香酸，乙酰基-β-乳香酸，11-酮基-β-乳香酸，乙酰基-11-酮-β-乳香酸等在内的五环三萜酸组通过针对不同分子靶标的特性显示出巨大的抗癌潜力。关于11-羰基-β-乳香酸在人类肺癌中的抗癌作用相关研究至今尚较少。 本研究针对11-羰基-β-乳香酸对人体肺癌细胞A549和H446的体外作用进行了以下三方面研究：1.观察11-羰基-β-乳香酸对细胞增殖、凋亡以及细胞周期的影响；2.探讨11-羰基-β-乳香酸对细胞凋亡作用的机制；3.研究11-羰基-β-乳香酸对肺癌细胞侵袭以及转移的影响。研究结果可能为后续开发以11-羰基-β-乳香酸为主要成分的低毒副、高效新型抗癌药物并更好的应用于临床治疗提供理论依据。 第一部分：11-羰基-β-乳香酸对细胞增殖、凋亡以及细胞周期的影响 目的：观察11-羰基-β-乳香酸对肺癌细胞增殖、凋亡以及细胞周期的影响。 方法：采用MTT比色法、Edu染色荧光显微镜检测法、流式细胞术实验方法观察不同浓度梯度的11-羰基-β-乳香酸作用下肺癌细胞A549和H446的生长曲线，细胞形态学变化及细胞内活性氧簇(ROS)水平的改变，运用Hochest33258染色法、AnnexinV-FITC/PI双染色法、JC-1染色法检测11-羰基-β-乳香酸对A549和H446细胞凋亡指数、细胞凋亡率以及线粒体膜电位的影响。所有数据使用SPSS软件(版本19.0，SPSSInc.，Chicago)进行分析，P＜0.05为显著差异。 结果： 1.细胞形态学观察： 与对照组相比，11-羰基-β-乳香酸处理后的A549和H446细胞形态特点类似，分布稀疏，细胞间隙变大，形态极为不规则，大量细胞收缩变圆，细胞膜的折光性下降，核染色质凝聚在一起，细胞核不断固缩，细胞的粘附性下降，细胞菌落小于对照组，而且随着时间的增加，细胞逐一脱落，很多细胞处在漂浮的状态。残余细胞脱离集落生长的特性，转为单个生长。 2.11-羰基-β-乳香酸对A549和H446细胞增殖和细胞周期的影响 用不同浓度的11-羰基-β-乳香酸处理细胞24小时，MTT方法检测细胞存活率显示，11-羰基-β-乳香酸浓度和A549及H446细胞的增殖之间，存在着显著的负相关，流式细胞仪分析，11-羰基-β-乳香酸诱导A549和H446细胞阻滞于G2/M期。 3.11-羰基-β-乳香酸对A549和H446细胞凋亡的影响 Hochest33258荧光染色观察显示高剂量(23.5和44.8μM)组11-羰基-β-乳香酸作用后促进细胞凋亡体的生成，可见凋亡体、核染色质固缩、核碎裂、边缘化和不均匀分布，其凋亡指数(除低浓度的4.2μM组外)显著高于对照组。AnnexinV-FITC/PI双染法检测到11-羰基-β-乳香酸剂量与细胞凋亡率成正比。 4.荧光探针DCFH-DA检测显示不同剂量11-羰基-β-乳香酸(4.2-44.8μM)作用细胞48小时，细胞内ROS水平明显增加，体现剂量反应关系，其中23.5μM、44.8μM处理组细胞内的DCF荧光强度值增加倍数最大。与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05) 5.使用JC-1染色法检测H446和A549细胞线粒体膜的电位变化，11-羰基-β-乳香酸能够增加这两类细胞的线粒体膜电位去极化程度，且具有剂量依赖效应，当药物浓度达到44.8μM时，A549和H446细胞分别降低(51.17±3.26)%、(53.08±2.11)%的ΔΨm。 小结： 11-羰基-β-乳香酸对于人类肺癌细胞A549和H446具有抑制细胞增殖的作用，11-羰基-β-乳香酸可通过诱导细胞凋亡和阻断细胞周期至G2-M期来抑制肿瘤细胞的生长，11-羰基-β-乳香酸可诱导肺癌细胞内ROS水平升高、使肺癌细胞内线粒体的膜电位(ΔΨm)下降，上述特征为研发11-羰基-β-乳香酸为主要成分的抗肿瘤药物提供了一定的理论依据。 第二部分：11-羰基-β-乳香酸对细胞凋亡的作用机制 目的：探讨11-羰基-β-乳香酸对细胞凋亡作用的机制 方法：采用RT-PCR技术从转录水平检测11-羰基-β-乳香酸作用下肺癌细胞A549凋亡相关基因的表达变化，并对其进行NF-κB活性检测，用Westernblot法检测在不同浓度11-羰基-β-乳香酸作用下促、抗凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达，并检测聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、凋亡抑制蛋白survivin以及JNK激酶的活性。 结果： 1.转录水平检测凋亡相关基因的表达变化： 在11-羰基-β-乳香酸作用12小时后，JNK1和FOXO1基因出现显著下调(P＜0.05)，P53和c-jun出现显著上调(P＜0.05)，且变化的趋势与药物作用时长呈正比。 2.11-羰基-β-乳香酸对NF-κB活性的影响： 11-羰基-β-乳香酸作用下，NF-κB活性被抑制，且为浓度依赖影响。 3.11-羰基-β-乳香酸对凋亡相关蛋白表达的影响： 在11-羰基-β-乳香酸作用下，促凋亡蛋白Bax表达为时间和浓度正相关性显著上调(P＜0.05)，而抗凋亡蛋白Bcl-2则表达为时间和浓度负相关性的显著下调(P＜0.05)。 4.11-羰基-β-乳香酸对PARP、凋亡抑制蛋白survivin以及JNK激酶的影响： WesternBlot检测显示11-羰基-β-乳香酸激活了PARP活性，下调凋亡抑制蛋白survivin表达，并激活JNK激酶的活性。 小结： 11-羰基-β-乳香酸作用于人类肺癌细胞A549时会出现细胞凋亡相关基因JNK1和FOXO1的下调，P53和c-jun的上调，细胞转录因子蛋白家族NF-κB的活性被抑制，促凋亡相关蛋白Bax表达上调，抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达下调，激活PARP裂解活性，抑制存活蛋白survivin并激活JNK激酶活性，11-羰基-β-乳香酸可能通过上述机制促进肿瘤细胞凋亡的发生，为探讨肺癌细胞凋亡机制提供了一定的理论依据。 第三部分：11-羰基-β-乳香酸对细胞侵袭以及转移的影响 目的：研究11-羰基-β-乳香酸对于肺癌细胞A549和H446迁移和侵袭能力的影响。 方法：通过细胞基质粘附实验检测不同剂量(4.2-44.8μM)的11-羰基-β-乳香酸对A549和H446细胞粘附能力的影响；采用Transwell迁移实验和细胞划痕实验检测11-羰基-β-乳香酸对上述肺癌细胞迁移能力的影响；Transwell基质胶侵袭实验检测11-羰基-β-乳香酸对上述肺癌细胞侵袭力的影响。 结果： 1.11-羰基-β-乳香酸对细胞粘附的影响： 应用不同剂量(4.2-44.8μM)的11-羰基-β-乳香酸后，A549和H446各组细胞的粘附能力均呈显著下降趋势。 2.11-羰基-β-乳香酸对细胞迁移的影响： Transwell小室实验和细胞划痕试验均显示在11-羰基-β-乳香酸的影响下，A549和H446细胞的迁移能力出现显著性下降。 3.11-羰基-β-乳香酸对细胞侵袭的影响： Transwell基质胶侵袭实验检测显示：A549和H446细胞受到不同浓度11-羰基-β-乳香酸作用24小时后侵袭能力普遍出现了降低，其中0μM、4.2μM、8.6μM、23.5μM、44.8μM剂量组超出基底膜的数量比空白对照组(P＜0.05)要少的多。 小结： 本部分内容通过细胞基质粘附实验、transwell小室实验、细胞划痕实验以及基质胶侵袭实验初步证明了11-羰基-β-乳香酸有可能抑制人类肺癌细胞A549和H446的细胞迁移和侵袭，为抑制晚期肺癌转移的天然药物成分研究提供了一定的理论依据。 结论： 11-羰基-β-乳香酸对人肺癌细胞A549和H446细胞增殖具有显著的抑制作用。11-羰基-β-乳香酸可能通过调节凋亡相关基因的表达、调节凋亡相关蛋白表达、抑制NF-κB活性、激活PARP活性，下调凋亡抑制蛋白survivin表达，并激活JNK激酶的活性等机制来促进诱导细胞凋亡的发生和阻断细胞周期至G2-M期来抑制肿瘤细胞的生长。11-羰基-β-乳香酸能显著抑制A549和H446细胞粘附迁移能力以及体外侵袭能力。需要进一步研究11-羰基-β-乳香酸的化学结构与抗癌活性之间的关系以及精确的分子靶标和分子调节机制。
非小细胞肺癌;乳香酸;A549细胞;H446细胞;细胞凋亡
河北医科大学
博士
外科学
刘俊峰
2019
中文
R734.2
2020-01-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）