依达拉奉对戊四氮致痫大鼠脑保护作用及机制探讨
癫痫是以脑神经元反复异常放电导致的发作性脑功能障碍为特征的神经系统疾病。癫痫发作可导致脑神经元的坏死或凋亡，继发中枢神经胶质细胞增生，导致异常兴奋性神经网络建立，造成反复痫性发作或癫痫持续状态。约有30％癫痫患者可伴有认知功能损伤。近年来癫痫中的认知功能障碍已成为研究的热点。 癫痫的病因学及发病机制复杂，目前仍未阐明，可能的发病机制包括：氧化应激反应、中枢胶质细胞增生、离子通道异常等多种机制。在众多发病机制中，氧化应激反应诱导的瀑布式自由基产生及损伤作用被认为是癫痫发病中损伤脑神经元的重要病理基础。通过自由基连锁式反应使细胞膜脂质及细胞核蛋白过度氧化，并损伤线粒体结构和功能，导致细胞能量产生不足从而导致细胞死亡或凋亡。因此，抗氧化应激反应和清除过量自由基可能是抗癫痫治疗的重要策略。 依达拉奉(Edaravone，EDA)，作为自由基清除剂，具有抗氧化应激，抑制脂质过氧化反应等作用。研究证实，依达拉奉可以通过抑制环氧化酶(Cyclooxygenase, Cyclooxygenase-1 ， COX-1 and Cyclooxygenase-2 ， COX-2)的活性而发挥对机体组织的保护作用。COX-2主要在海马组织和皮质神经元中表达并可以介导神经元的损伤。COX-2是前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)代谢产生的关键酶和限速酶，同时又能促进一氧化氮(nitric oxide，NO)的产生，而前列腺素E2、一氧化氮能够参与炎症、氧化应激、凋亡等多种病理过程。因此，具有抗氧化作用的依达拉奉可能成为治疗癫痫的新型药物。 本研究通过腹腔注射戊四氮(pentylenetetrazoloe, PTZ)建立慢性点燃大鼠癫痫模型，给予不同剂量依达拉奉进行干预，观察不同剂量依达拉奉对癫痫大鼠的痫性发作等级、全面性强直-阵挛发作潜伏期和极小阵挛性发作潜伏期、认知功能及海马组织中氧化应激参数和神经元的影响，并检测海马组织中COX-2的mRNA及蛋白表达水平，探讨依达拉奉对戊四氮致痫大鼠是否具有脑保护作用及其可能的机制，为抗癫痫药物的选择提供新的思路和实验依据。本研究共分为三部分，各部分内容分述如下。 第一部分依达拉奉对戊四氮致痫大鼠痫性发作和认知功能的作用 目的：建立戊四氮慢性点燃雄性白化型大鼠癫痫模型，观察癫痫大鼠的痫性发作等级、全面性强直-阵挛发作潜伏期(Generalized tonic clonic seizure latency，GTCS)、极小阵挛性发作潜伏期(Minimal latency of clonic seizures，MCS)和大鼠认知功能变化，以及依达拉奉对癫痫大鼠的干预作用。 方法：取8-12周清洁级健康雄性白化型Wistar大鼠(200-220 g)60只，随机分为四组：Sham组、Control组、PTZ+Edaravone5mg/kg组和PTZ+Edaravone10mg/kg组，每组15只。PTZ于每次给药前溶于生理盐水新鲜配制，Edaravone、PTZ均在08:00-10:00之间给予腹腔注射。Sham组隔日腹腔注射0.9％NaCl(10 ml/kg)，共15次。Control组隔日腹腔注射PTZ(90 mg/kg)，共15次，每日腹腔注射0.9％NaCl(10 ml/kg)，生理盐水注射30min后再给予PTZ(90 mg/kg)腹腔注射。PTZ+Edaravone5mg/kg组：隔日腹腔注射PTZ(90 mg/kg)，共15次，每日腹腔注射5mg/kgEdaravone，Edaravone注射30min后再给予PTZ(90 mg/kg)腹腔注射。PTZ+Edaravone10mg/kg组：隔日腹腔注射PTZ(90 mg/kg)，共15次，每日腹腔注射10mg/kgEdaravone，Edaravone注射30min后再给予PTZ(90 mg/kg)腹腔注射。每次PTZ给药后，观察大鼠的行为变化。参照Racine(1972)行为学分级法对大鼠癫痫发作进行分级。最后一次PTZ给药24h后，行Morris水迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力。 结果： 1连续腹腔注射PTZ后，大鼠出现痫性发作，从最初的凝视、点头、洗脸样动作起，痫性发作等级逐渐升高，并最终出现全身强直-阵挛样大发作。与Control组比较，PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)药物干预均能够有效降低戊四氮点燃癫痫大鼠的痫性发作等级(P＜0.05)，依达拉奉(5 mg/kg、10 mg/kg)组间在降低大鼠痫性发作方面对比无明显差异(P＞0.05)。Sham组大鼠未出现痫性发作。并且与Control组大鼠比较，依达拉奉(5 mg/kg、10 mg/kg)药物干预后均能够显著延长癫痫大鼠的全面性强直-阵挛发作潜伏期(GTCS )和极小阵挛性发作潜伏期(MCS)(P＜0.05)，且高剂量依达拉奉药物干预组较低剂量组在延长潜伏期方面效果更为明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 2Morris水迷宫检测结果 2.1定位航行实验结果：对每日逃避潜伏期的平均值进行比较，结果显示，(1)Sham组、Control组、PTZ+Edaravone5mg/kg组、PTZ+Edaravone10mg/kg组大鼠的逃避潜伏期在第1、2天无统计学意义(P＞0.05)。(2)实验第3、4、5天，与Sham组大鼠比较，Control组大鼠的逃避潜伏期明显延长(P＜0.05)；PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)药物干预后大鼠的逃避潜伏期较Control组大鼠均明显缩短(P＜0.05)；PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)大鼠的逃避潜伏期和Sham组大鼠对比没有明显差异性变化(P＞0.05)。PTZ+Edaravone(5 mg/kg、10 mg/kg)组之间潜伏期对比，差异无明显统计学意义(P＞0.05)。 2.2空间探索实验结果：Control组大鼠120s内穿越平台区域的次数明显低于Sham组(P＜0.05)；PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)大鼠120s内穿越平台区域的次数与Control组比较均明显增多(P＜0.05)。PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)大鼠穿越平台区域的次数和Sham组比较均没有明显差异性变化(P＞0.05)。PTZ+Edaravone(5 mg/kg、10 mg/kg)组之间比较，差异无明显统计学意义(P＞0.05)。 结论：连续给予戊四氮腹腔注射能够成功建立慢性点燃大鼠癫痫模型，依达拉奉干预能明显降低癫痫大鼠痫性发作等级、延长全面性强直-阵挛发作潜伏期和极小阵挛性发作潜伏期，延缓了戊四氮点燃大鼠癫痫进程，表明依达拉奉具有抗癫痫的作用。依达拉奉干预后癫痫大鼠在Morris水迷宫实验中的空间学习记忆能力与癫痫组大鼠对比有明显增强，表明依达拉奉对戊四氮点燃大鼠模型的认知功能损伤有显著的改善作用。 第二部分依达拉奉对戊四氮致痫大鼠脑组织氧化应激状态的作用 目的：观察戊四氮点燃癫痫大鼠的脑组织氧化应激反应及依达拉奉对癫痫大鼠海马组织抗氧化防御能力的保护作用。 方法：取8-12周清洁级健康雄性白化型Wistar大鼠(200-220 g)60只，随机分为四组：Sham组、Control组、PTZ+Edaravone5mg/kg组和PTZ+Edaravone10mg/kg组，每组15只。PTZ于每次给药前分别溶于生理盐水新鲜配制，Edaravone、PTZ均在08:00-10:00之间给予腹腔注射。Sham组隔日腹腔注射0.9％NaCl(10 ml/kg)，共15次。Control组隔日腹腔注射PTZ(90 mg/kg)，共15次，每日腹腔注射0.9％NaCl(10 ml/kg)，生理盐水注射30min后再给予PTZ(90 mg/kg )腹腔注射。PTZ+Edaravone5mg/kg组：隔日腹腔注射PTZ(90 mg/kg)，共15次，每日腹腔注射5mg/kgEdaravone，Edaravone注射30min后再给予PTZ(90 mg/kg)腹腔注射。PTZ+Edaravone10mg/kg组：隔日腹腔注射PTZ(90 mg/kg)，共15次，每日腹腔注射10mg/kgEdaravone，Edaravone注射30min后再给予PTZ(90 mg/kg)腹腔注射。最后一次PTZ给药24h后，各组大鼠尾静脉抽血检测NO水平；取大鼠海马组织根据试剂盒说明书检测：丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(Glutathione， GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase， Gpx)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase ，SOD)、硫醇(Thiol content)含量的改变；应用流式细胞仪检测大鼠海马组织细胞内检测海马组织细胞活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、和线粒体膜电位(mitochondrialtransmembranepotential,△Ψm)的水平。 结果： 1.氧化应激参数 与Sham组相比，Control组、PTZ+Edaravone5mg/kg组大鼠海马组织中抗氧化应激参数GSH、SOD、CAT、Gpx、Thiolcontent含量降低(P＜0.05)，氧化应激参数MDA含量升高(P＜0.05)。与Control组对比，PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)治疗后大鼠海马组织中抗氧化参数GSH、SOD、CAT、Gpx、Thiolcontent含量均明显升高(P＜0.05)，氧化应激参数MDA水平均明显降低(P＜0.05)。PTZ+Edaravone10mg/kg组与PTZ+Edaravone5mg/kg组对比，各项氧化应激参数含量存在差异(P＜0.05)，而与Sham组在各项氧化应激参数含量方面对比差异无明显统计学意义(P＞0.05)。 2.海马组织细胞内活性氧(ROS)和线粒体膜电位(△Ψm)水平 与Sham组相比，Control组、PTZ+Edaravone5mg/kg组、PTZ+Edaravone10mg/kg组海马组织细胞中ROS的水平升高(P＜0.05)，△Ψm水平显著下降(P＜0.05)；与Control组相比，PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)治疗后癫痫大鼠海马组织细胞中ROS水平均显著下降(P＜0.05)，△Ψm水平均明显升高(P＜0.05)。PTZ+Edaravone10mg/kg组与PTZ+Edaravone5mg/kg组相比大鼠海马组织细胞中ROS水平和△Ψm水平，差异均无统计学意义(P＞0.05) 3.NO含量检测 与Sham组相比，Control组、PTZ+Edaravone5mg/kg组、PTZ+Edaravone10mg/kg组大鼠血清NO水平升高(P＜0.05)。与Control组对比，PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)药物干预后癫痫大鼠血清NO水平均明显下降(P＜0.05)。PTZ+Edaravone组(5mg/kg、10mg/kg)之间NO含量对比，差异无明显统计学意义(P＞0.05)。 结论：戊四氮点燃大鼠海马组织内发生明显氧化应激反应，抗氧化能力受损，依达拉奉能够有效减轻癫痫大鼠脑内氧化应激损伤，保护癫痫大鼠海马组织细胞的抗氧化防御能力及海马神经元线粒体的功能。 第三部分依达拉奉对戊四氮致痫大鼠海马组织神经元的保护作用 目的：观察不同剂量依达拉奉对癫痫大鼠海马组织Nissl染色结果及海马组织细胞的凋亡率、前列腺素E2水平、COX-2的mRNA及蛋白表达水平的影响，探讨依达拉奉对戊四氮致痫大鼠海马神经元的保护作用及可能的机制。 方法：取8-12周清洁级健康雄性白化型Wistar大鼠(200-220 g)60只，随机分为四组：Sham组、Control组、PTZ+Edaravone5mg/kg组和PTZ+Edaravone10mg/kg组，每组15只。PTZ于每次给药前分别溶于生理盐水新鲜配制，Edaravone、PTZ均在08:00-10:00之间给予腹腔注射。Sham组隔日腹腔注射0.9％NaCl(10 ml/kg)，共15次。Control组隔日腹腔注射PTZ(90 mg/kg)，共15次，每日腹腔注射0.9％NaCl(10 ml/kg)，生理盐水注射30min后再给予PTZ(90 mg/kg )腹腔注射。PTZ+Edaravone5mg/kg组：隔日腹腔注射PTZ(90 mg/kg)，共15次，每日腹腔注射5mg/kgEdaravone，Edaravone注射30min后再给予PTZ(90 mg/kg)腹腔注射。PTZ+Edaravone10mg/kg组：隔日腹腔注射PTZ(90 mg/kg)，共15次，每日腹腔注射10mg/kgEdaravone，Edaravone注射30min后再给予PTZ(90 mg/kg)腹腔注射。最后一次PTZ给药24h后，各组大鼠取脑，进行Nissl染色观察大鼠海马神经元形态，应用流式细胞仪定量分析大鼠海马神经元凋亡情况，检测各组大鼠海马组织中PGE2含量，通过Westernblot、Real-timePCR方法定量COX-2的mRNA及蛋白表达水平。 结果： 1.Nissl染色结果在海马组织CA1、CA3区，Sham组大鼠海马神经元形态完整、细胞核仁清晰，胞浆内尼氏体丰富，锥体细胞排列规则、紧密，未发现明显神经元丢失；与Sham组比较，Control组大鼠海马神经元丢失较为明显，细胞排列紊乱，细胞核固缩、尼氏体数量减少；与Control组对比，PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)药物干预后大鼠海马组织神经元边缘清晰，尼氏体数量明显增加，神经元丢失明显改善。 海马神经元存活数量：与Sham组相比，Control组、PTZ+Edaravone5mg/kg组、PTZ+Edaravone10mg/kg组大鼠海马CA1区和CA3区神经元数量均下降(P＜0.05)。与Control组相比，PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg )治疗后存活神经元的数量均明显增加(P＜0.05)。PTZ+Edaravone10mg/kg组与PTZ+Edaravone5mg/kg组相比，海马组织神经元存活数量差异有统计学意义(P＜0.05)。 2.细胞凋亡率 与Sham组相比较，Control组、PTZ+Edaravone5mg/kg组、PTZ+Edaravone10mg/kg组大鼠海马组织细胞凋亡率增加(P＜0.05)；与Control组比较，PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)治疗后癫痫大鼠海马组织细胞凋亡率明显下降(P＜0.05)。PTZ+Edaravone10mg/kg组与PTZ+Edaravone5mg/kg组对比，大鼠海马组织细胞凋亡率差异有统计学意义(P＜0.05)。海马组织细胞凋亡率的结果与Nissl染色的结果一致。 3.PGE2含量检测 与Sham组相比，Control组大鼠海马组织PGE2水平明显升高(P＜0.05)。与Control组对比，给予PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)治疗后癫痫大鼠PGE2水平均明显下降(P＜0.05)。 4.Real-timePCR检测COX-2mRNA在大鼠海马组织的表达 COX-2表达水平以β-actionmRNA作为参照。与Sham组相比，Control组、PTZ+Edaravone5mg/kg组、PTZ+Edaravone10mg/kg组大鼠海马组织COX-2mRNA表达水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与Control组相比，PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)治疗后癫痫大鼠海马组织COX-2mRNA表达均明显降低(P＜0.05)；PTZ+Edaravone10mg/kg组与PTZ+Edaravone5mg/kg组对比存在差异(P＜0.05)。 5.Westernblot检测COX-2在大鼠海马组织中的表达 COX-2蛋白表达水平以β-action作为参照，与Sham组相比，Control组、PTZ+Edaravone5mg/kg组、PTZ+Edaravone10mg/kg组大鼠海马组织COX-2蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与Control组相比，PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)治疗后癫痫大鼠海马组织COX-2蛋白表达水平均明显降低(P＜0.05)；PTZ+Edaravone10mg/kg组与PTZ+Edaravone5mg/kg组之间对比，差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论：戊四氮点燃癫痫大鼠海马组织存在明显海马神经元损伤及细胞凋亡情况，前列腺素E2含量明显增加，并且COX-2在mRNA和蛋白水平表达增加。依达拉奉干预能够下调COX-2mRNA和蛋白的表达，抑制前列腺素E2的产生，进而保护海马神经元结构及功能，改善海马组织细胞的凋亡。因此推测，依达拉奉可能通过调节COX-2/PGE2的异常表达，而减轻癫痫发作诱导的氧化应激损伤及大鼠海马神经元的凋亡，改善癫痫大鼠的认知功能障碍，这可能是依达拉奉脑保护作用的机制。
癫痫;依达拉奉;环氧化酶Ⅱ;脑保护作用
河北医科大学
博士
神经病学
王维平
2019
中文
R742.1
2020-01-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）