清心开窍方对APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆和mTOR通路的影响
目的：探讨清心开窍方对APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆和mTOR通路的影响。 方法：选用SPF级雄性APP/PS1双转基因小鼠（25±3g）40只，4月龄，按随机数字表法随机分为5组，模型组，安理申组，清心开窍方低剂量组，清心开窍方中剂量组，清心开窍方高剂量组，每组8只。另选取同月龄同性别同背景的C57BL/6J小鼠8只为对照组。所有小鼠于温州医科大学SPF级动物房饲养，适应环境7天后进行灌胃，安理申组的剂量为1.67mg/kg/d，清心开窍方组的剂量分别为低剂量组（4.75mg/kg/d），中剂量组（9.5mg/kg/d），高剂量组（19mg/kg/d）。对照组，模型组分别灌服等体积的生理盐水，连续90天。治疗90天后，采用Morris水迷宫测试小鼠的空间学习记忆能力，包括定位航行实验（逃避潜伏期）和空间探索实验（穿台次数）。Morris水迷宫测试结束后，将各组小鼠经心脏依次灌注生理盐水及4％多聚甲醛固定，用TUNEL染色法检测小鼠海马区细胞凋亡情况，用六胺银染色法检测海马区Aβ的沉积，用Nissl染色法检测小鼠海马CA1区及CA3区神经元排列及丢失情况。用免疫组化染色法检测海马区NeuN蛋白的表达水平，Aβ，GFAP，Iba1在海马区与皮层区的表达水平。蛋白免疫印迹法检测小鼠海马中NeuN，p-AMPK，p-mTOR，p-S6K，Bace1的表达。 结果： 1.Morris水迷宫 在Morris水迷宫测试中，所有小鼠都能够正常游泳并在训练试验期间找到隐藏的平台，所有组中小鼠的游泳速度没有显示出差异（P＞0.05）。与对照组小鼠相比，模型组APP/PS1双转基因小鼠逃避潜伏期延长，而且在空间探索实验中平台交叉次数明显减小（P＜0.01）；经药物干预后，各治疗组小鼠的逃避潜伏期有不同程度的缩短，平台交叉次数也均有不同程度的升高（P＜0.05；P＜0.01）；与AD模型组相比，单独使用安理申治疗或使用清心开窍方治疗的小鼠缩短了逃避潜伏期，特别是在中剂量组效果最为显著（P＜0.01）；与安理申组比较，清心开窍方低、中、高剂量组逃避潜伏期稍延长，其中，中剂量组结果最为接近且差异无统计学意义（P＞0.05）。可见清心开窍方对APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆能力有一定的改善作用。 2.尼氏染色 Nissl染色显示海马CA1区和CA3区存活神经元的数量。海马CA1区和CA3区对照组小鼠的神经元数量较多，排列整齐，富含尼氏体（深蓝色），浅蓝色核，浅蓝色背景;海马CA1区和CA3区模型组小鼠神经元数量减少，排列紊乱，尼氏体边界模糊或消失，核固缩或核溶解形成椭圆形或三角形，染成深蓝色;安理申组和中剂量清心开窍方组的神经元在海马CA1区和CA3区明显增多，排列整齐，尼氏体较多，核固缩少，核溶解。 3.TUNEL染色 与对照组相比，模型组APP/PS1双转基因小鼠的大脑皮层区凋亡细胞显著增多（P＜0.01）；与模型组相比，清心开窍方低、中、高剂量组和安理申组凋亡细胞显著减少（P＜0.01）；清心开窍方中剂量组与清心开窍方低、高剂量组相比，清心开窍方低、高剂量组小鼠大脑海马区凋亡细胞显著增多（P＜0.01）。 4.六胺银染色 与对照组、安理申组、清心开窍方低、中、高剂量组相比，模型组APP/PS1双转基因小鼠大脑海马区老年斑阳性数量显著增多（P＜0.01）；与模型组相比，清心开窍方低、中、高剂量组和安理申组老年斑阳性数量显著减少（P＜0.01）；清心开窍方中剂量组与清心开窍方低、高剂量组相比，清心开窍方低、高剂量组小鼠大脑海马区老年斑阳性数量显著增多（P＜0.01）。 5.免疫组化检测结果 与对照组相比，模型组海马区NeuN的表达减少（P＜0.01），海马和皮层区的Aβ、Iba1、GFAP的表达增加（P＜0.01）；与模型组相比，清心开窍方各组NeuN表达增加（P＜0.01，P＜0.05）,Aβ、Iba1、GFAP的表达减少（P＜0.01，P＜0.05）；与中剂量组相比，高剂量组NeuN表达减少（P＜0.05）,Iba1、GFAP的表达增加（P＜0.01），低剂量组Aβ、Iba1、GFAP的表达增加（P＜0.01，P＜0.05）。 6.WesternBlot检测结果 与对照组比较，模型组p-mTOR、p-S6K、Bace1蛋白表达均升高（P＜0.01，P＜0.05）,p-AMPK、NeuN蛋白表达降低（P＜0.01）；与模型组比较，清心开窍方低、中、高剂量组海马区p-mTOR、p-S6K、Bace1蛋白表达均减少（P＜0.01，P＜0.05）；与中剂量组比较，清心开窍方低、高剂量组海马区p-mTOR、p-S6K、Bace1蛋白表达均升高（P＜0.01，P＜0.05），p-AMPK、NeuN蛋白表达降低（P＜0.01）。 结论： 1.清心开窍方能够有效改善APP/PS1小鼠海马的认知缺陷，并提供神经保护； 2.清心开窍方可以减轻了淀粉样蛋白生成和炎症反应，减少脑内老年斑沉积； 3.清心开窍方的潜在机制可能是通过调节AMPK/mTOR/S6K/Bace1信号； 4.清心开窍方低、中、高剂量组均有不同程度的抗AD作用，其中中剂量组疗效最明显。
清心开窍方;阿尔茨海默症;神经炎症;mTOR通路;动物实验
温州医科大学
硕士
中西医结合
胡海燕
2019
中文
R749.16;R285.5
2020-01-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）