机械通气通过外泌体miR--21负调控Notch2促进肺部炎症反应
目的:探讨机械通气诱导肺组织中升高的miR-21是否通过外泌体的方式导致肺部炎症,并确定其发挥作用的靶分子是否为Notch2. 方法:实验分为三个部分: 实验一:机械通气肺损伤中miR-21及Notch2的变化.实验分组:(1)对照组(Ctrl);(2)MV 2h组;(3)MV6h组;(4)MV12h组,每组8只c57雄性小鼠.腹腔注射2%戊巴比妥麻醉后经气管切开进行机械通气,机械通气设置参数为:潮气量30ml/kg,呼吸频率100次/分,吸呼比(I∶E)=1∶1,呼气末正压(PEEP)=0mmHg,吸入氧浓度(FiO2)=21%.通气结束后经腹主动脉放血处死小鼠,结扎右肺门,行左侧肺灌洗收集肺泡灌洗液(BALF),用 BCA 法检测BALF中总蛋白浓度,ELISA法检测BALF中炎症细胞因子IL-6,TNF-α含量;右侧肺上叶用于测量肺湿干比重,中叶进行HE染色观察肺组织病理结果,下叶进行Western blotting检测Notch2及Hes-1蛋白表达,楔叶用于提取总RNA,检测miR-21、Notch2 mRNA的表达. 实验二:机械通气释放外泌体携带miR-21通过负调控Notch2导致肺部炎症.实验分组:据实验一选取通气12小时作为该部分实验的时间点,(1)Ctrl组;(2) MV 12h组;(3)GW4869+MV 12h组,每组8只c57雄性小鼠.通气前1小时GW4869+MV 12h组尾静脉注射GW4869,剂量为2.5μg/g ;Ctrl组及MV 12h组尾静脉注射等剂量的 2.5%DMSO,按照第一部分实验内容进行机械通气.通气结束后收集 BALF 进行超速离心获得外泌体并通过透射电镜进行鉴定,PCR检测外泌体中miR-21含量;检测BALF中总蛋白浓度,炎症细胞因子IL-6、TNF-α的含量;观察肺组织病理切片HE染色片,评估肺损伤程度;检测肺组织中Notch2 mRNA及蛋白表达情况,检测肺组织中Notch2下游分子Hes-1的蛋白表达情况. 实验三:在细胞上研究Notch2可作为miR-21的下游靶基因.Raw264.7细胞系随机分为以下几组:(1)miR-21 negative control组(NC);(2)miR-21 mimic组(miR-21 mimic);(3)miR-21 inhibitor组(miR-21 inhibitor).转染72小时后用RT-PCR法检测Notch2 mRNA的表达情况,用Western blotting检测Notch2蛋白表达情况. 结果:实验一结果显示,与对照组相比,通气组中肺泡结紊乱、炎性细胞浸润、肺泡壁增厚充血,且通气12小时组比通气2小时和6小时组的肺泡壁增厚更明显、肺泡结构破坏更严重,而对照组肺泡形态结构正常,几乎无炎性细胞浸润;通气12小时组中肺组织湿干比重、BALF中总蛋白含量、BALF中细胞因子IL-6和TNF-α增加最为明显;机械通气可导致肺组织中miR-21表达水平增加、Notch2 mRNA表达降低,Notch2和Hes-1蛋白表达降低,且在通气12小时组中改变最明显. 实验二结果显示,机械通气可导致外泌体释放进入BALF中,且RT-PCR检测外泌体中的miR-21发现,MV 12h小时组中miR-21明显高于Ctrl组;尾静脉给予外泌体释放抑制剂GW4869后再通气12小时BALF中miR-21的含量明显降低;与MV 12h组相比,GW4869+MV 12h组中肺部炎症细胞浸润、肺泡壁充血及肺泡壁增厚等情况均有明显改善,BALF中总蛋白含量、BALF中细胞因子IL-6和TNF-α含量降低;肺组织中Notch2 mRNA及蛋白表达增加,Hes-1蛋白表达增加. 实验三结果显示转染miR-21 mimic后,Notch2 mRNA及蛋白表达增加;转染miR-21 inhibitor后,Notch2 mRNA及蛋白表达降低. 结论:机械通气诱导含有miR-21的外泌体释放并且miR-21可通过负调控Notch2促进肺部炎症反应.
肺损伤;炎症反应;机械通气;外泌体miR-21;Notch2分子
华中科技大学
硕士
麻醉学
武庆平
2019
中文
R563
2019-12-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）