氧化石墨烯作为牙再生支架的可行性研究
目的: 本课题旨在分析细胞在氧化石墨烯(graphene oxide，GO)支架上附着、生长和钙化能力，探索GO支架的生物相容性及其作为新型牙再生支架的可行性。 方法: 1采用改良组织块法培养大鼠牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)并采用 CD34、CD44 和 STRO-1 抗体进行免疫荧光染色鉴定。采用酶消化法培养胎鼠下颌突的牙源性上皮细胞(dental epithelial cells，DECs)并采用CK14抗体进行免疫荧光染色鉴定。2 采用 Hummers 法和梯度冷冻干燥法制备三维 GO 支架，通过扫描电镜观察支架表面形态，拉曼光谱仪进行材料成分测定。3 将 DPSCs 分别接种到 α-MEM 培养基(对照组)和含有不同浓度 GO 分散液的培养基(实验组)内，24小时后通过 MTT 法检测各组吸光度，计算出细胞成活率，以分析 GO 是否有细胞毒性。4 将 GO 支架放入有 DPSCs 细胞的培养基培养 3 天，用免疫荧光染色法检测 tubulin-β，以观察细胞在支架上的附着情况。5 按照分层接种法将 DPSCs 和DECs 按照 1∶1 的比例接种到 GO 支架(DPCSs/DECs/GO 组)和明胶海绵支架(DPCSs/DECs/GS 组)上，在体外构建上皮—间充质干细胞立体培养模型并移植到大鼠大网膜内。4周后取材，行组织学观察和牙本质涎蛋白(Dentin sialoprotein， DSP)的免疫组化染色，检测移植物内组织的生成状况。采用扫面电镜观察移植物内组织形态，能谱仪测定移植物内钙磷元素含量，X 线衍射仪测定移植物组织结构，与正常牙齿进行对比，检测矿化程度。动物体内实验是为了活体分析细胞在GO支架上的分化能力。 结果: 1 培养所得牙髓细胞不表达造血干细胞表面标记物 CD34，阳性表达间充质干细胞表面标记物CD44和STRO-1，证实该细胞为DPSCs。培养所得下颌突细胞阳性表达上皮细胞标记物CK14，证实该细胞为DECs。2 GO支架表征学测定结果表明，该支架孔径为 50-100μm，孔隙率高达 95%，表面有皱褶结构；拉曼光谱结果显示，D峰出现在1355cm-1，G峰出现在1582cm-1，符合GO的特点。3 MTT实验结果显示，GO 分散液组细胞活性与 α-MEM 组无显著性差异(P＞0.05)，说明GO 无细胞毒性。4 免疫荧光结果显示 DPSCs 细胞在 GO 支架上生长良好，能够很好地黏附和伸展。说明 GO 具有良好的生物相容性。5 动物体内实验结果：HE染色显示每组支架均有新生组织长入，细胞生长良好，DPCSs/DECs/GO 组可见均质红染的钙化物质形成；免疫组化染色可见DPCSs/DECs/GS组DSP阴性表达，个别地方呈弱阳性。而 DPCSs/DECs/GO 组 DSP 呈强阳性；扫描电镜图像可见DPCSs/DECs/GO 组内有胶原和血管形成，细胞生长良好。能谱仪检测结果显示移植物内有少量钙磷物质表达，X线衍射仪结果可见移植物尚未达到正常牙齿的矿化水平，说明矿化程度较低。动物实验结果表明与GS相比GO支架更有助于DPSCs分化。 结论: 1 采用改良组织块法能够获得大鼠 DPSCs；采用酶消化法可以培养出胎鼠DECs。2 GO支架具有良好的生物相容性，有利于DPSCs的生长与附着。3 GO作为牙再生新型支架，对DPSCs体内牙向分化具有一定的促进作用。
氧化石墨烯;牙再生支架;牙髓干细胞;细胞分化;生物相容性
华北理工大学
硕士
口腔临床医学
李健
2019
中文
R783.1
2019-12-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）