Ssc-novel-mir-106-5p在LPS诱导的母猪子宫内膜上皮细胞炎症反应中的作用
子宫内膜炎是导致母猪流产，产仔率下降，母猪淘汰率升高的主要原因，给养猪产业造成了巨大的经济损失。现有的子宫内膜炎的治疗方法还不能达到理想的治疗效果，寻求更为有效的治疗母猪子宫炎症的新方法迫在眉睫。通过探究LPS诱导的牛子宫内膜上皮细胞中的炎症发生机制，可以为治疗子宫内膜炎提供新的思路。然而，LPS诱发子宫内膜炎的分子机制尚不明确，miRNA是否参与猪子宫内膜炎的发病过程还知之甚少。本研究旨在探究miRNA在猪子宫内膜炎发生时的作用机制，以找到新的治疗猪子宫内膜炎的方法。 本试验采用6-7月龄的未发情母猪子宫作为试验材料，利用体外培养的子宫内膜细胞主要研究以下几个问题：（1）是否存在新的参与 LPS 诱导的子宫内膜上皮细胞炎症反应的 miRNA；（2）差异表达的 miRNA 通过作用于哪个靶基因作用并调控炎症相关通路；（3）差异表达的miRNA是否通过影响炎症反应相关通路的激活调节相关炎性因子的分泌。 本试验在前期预试验确定LPS剂量的基础上，用LPS处理子宫内膜上皮细胞，处理结束后提取 RNA 进行高通量测序，找出表达差异显著的 miRNA。将测序结果与生物信息分析相结合，预测差异 miRNA 可能的靶基因。通过双荧光素酶、qRT-PCR验证与miRNA相互作用的靶基因。通过上调或下调miRNA在细胞中的水平，采用Western blotting、ELISA、qRT-PCR确定miRNA对靶基因、NF-κB通路及炎症因子（ TNF-α， IL-1 ）分泌的作用。最后，添加 NF-κB 通路抑制剂BAY11-7082确定子宫内膜细胞中NF-κB与炎症因子（TNF-α，IL-1）分泌之间的关系。 试验结果发现： （1）LPS作用于子宫内膜细胞后诱导了393个miRNA表达， 10个miRNA的表达发生显著变化，其中 9 个下调（ ssc-miR-127 ， ssc-miR-199a-1 ， ssc-novel-miR-106-5p 等）1 个上调（ssc-miR-1249-1），9 个已知 1 个未知（除ssc-novel-miR-106-5p外均已知），这些基因主要富集在PI3K、MAPK等信号通路。 （2）与阴性对照组（NC）相比，miR-106-5p模拟物组MAP3K14的海肾荧光素酶/萤火虫荧光素酶活性降低34.87％（P＜0.05），模拟物组MAP3K14的海肾荧光素酶/萤火虫荧光素酶活性与抑制剂组的荧光素酶活性相比降低了 75.41%（P＜0.01）。 （3）添加miR-106-5p模拟物后，与阴性对照（NC）相比，miR-106-5p模拟物组中MAP3K14的mRNA表达下降71.45％（P＜0.01），MAP3K14蛋白表达下降38.04％（P ＜0.01）；而miR-106-5p抑制剂组与阴性对照（NC）相比，MAP3K14蛋白与mRNA表达分别上调30.75%（P＜0.01），12.45%（P<0.05）。 （4）与对照组相比，加入miR-106-5p模拟物组，NF-κB磷酸化水平下降35.69％（P <0.01），TNF-α和IL-1浓度分别降低了39.5％和59.85％（P＜0.01）；加入miR-106-5p抑制物NF-κB磷酸化水平增加72.90%（P＜0.01），TNF-α和IL-1浓度分别增加188.86%（P ＜0.01）和18.77%（P<0.05），LPS组中NF-κB磷酸化水平增加85.88%，TNF-α和IL-1浓度分别增加116.24%和35.90%（P＜0.01）。 （5）与LPS组相比，添加miR-106-5p模拟物组中TNF-α和IL-1浓度分别降低了39.5％和59.85％（P＜0.01）；miR-106-5p抑制物组和LPS组中与对照组相比， TNF-α和IL-1分泌量分别上升25.13%和14.42%（P＜0.05）。 （6）添加抑制剂BAY 11-7082后，细胞中NF-κB磷酸化水平下降76.45％（P＜0.01），TNF-α和IL-1的分泌量分别下降40.62%（P＜0.01）与54.41%（P＜0.05）。 根据以上结果，得出以下结论： （1）MAP3K14是ssc-novel-miR-106-5p的靶基因，miR-106-5p能通过靶向调控MAP3K14的3'UTR区抑制MAP3K14 mRNA的表达。 （2）LPS通过下调子宫内膜上皮细胞中的miR-106-5p表达，增强MAP3K14的表达。 （3）MAP3K14 表达增强能增加 NF-κB 磷酸化水平，激活的 NF-κB 能促进TNF-α和IL-1分泌。 （4）BAY11-7082对猪子宫内膜细胞活性的影响具有剂量依赖性；BAY11-7082通过抑制子宫内膜细胞NF-κB激活，减少了TNF-α和IL-1分泌。 综上所述， LPS 使子宫内膜上皮细胞中 ssc-novel-mir-106-5p 下调， ssc-novel-mir-106-5p作为一种能靶向调控MAP3K14 mRNA表达和蛋白分泌的新型RNA，能抑制NF-κB激活，降低NF-κB磷酸化水平，当ssc-novel-mir-106-5p表达下调时，MAP3K14能促进NF-κB激活，进而增加炎症因子（TNF-α，IL-1）的分泌。
子宫内膜上皮细胞;子宫内膜炎;Ssc-novel-mir-106-5p;母猪
西南大学
硕士
基础兽医学
王鲜忠
2019
中文
S858.28
2019-12-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）