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    主要英文缩写表
    英文摘要
    中文摘要
    第一章 前 言
    第二章 Nr4a1在耐受T细胞中高表达
    2.1 材料与方法
    2.1.1 实验仪器和生产公司设备名称
    2.1.2 实验试剂、器材和生产公司实验试剂、器材
    2.1.3 实验抗体抗体
    2.1.4 主要溶液配置
    2.1.5 实验动物
    2.1.6 小鼠组织DNA提取
    2.1.7 小鼠基因型鉴定
    2.1.8小鼠na(i)ve CD4+T细胞分选
    2.1.9小鼠na(i)ve OT-Ⅱ细胞体外诱导耐受
    2.1.12 小鼠OT-Ⅱ肽诱导的耐受模型
    2.1.13 小鼠OVA·CFA皮下免疫
    2.1.14 细胞表面染色
    2.1.15 细胞因子刺激、染色
    2.1.16 核内蛋白染色
    2.1.17 数据结果分析与统计
    2.2 结果
    2.2.1 Nr4a1在耐受T细胞中高表达
    2.3 讨论
    第三章 Nr4a1是调控T细胞耐受的必要因子
    3.1 材料与方法
    3.1.1 主要溶液配置
    3.1.2 实验小鼠
    3.1.3 小鼠基因型鉴定
    3.1.4 小鼠结肠固有层淋巴细胞分离、富集
    3.1.5 H&E染色
    3.2 结果
    3.2.1 体内耐受模型中Nr4a1-/-OT-Ⅱ细胞增殖增加，细胞因子分泌增加
    3.2.2 Nr4a1-/-CD4+T细胞加重小鼠结肠炎症
    3.3 讨论
    第四章 敲除Nr4a1抑制CD8+T细胞耗竭
    4.1 材料与方法
    4.1.1 主要溶液配置
    4.1.2 实验细胞
    4.1.3 实验动物
    4.1.4 小鼠基因型鉴定
    4.1.5 E.G7细胞复苏、培养
    4.1.6 E.G7肿瘤细胞皮下接种小鼠
    4.1.7小鼠na(i)ve CD8+T细胞分选
    4.1.8 荷瘤小鼠分析
    4.1.9 实验病毒
    4.1.10 P14小鼠取血基因鉴定
    4.1.11 骨髓嵌合鼠构建
    4.1.12 LCMV-Clone13病毒感染，建立慢性感染模型
    4.1.13 小鼠肝脏、肺浸润的淋巴细胞分离、富集
    4.2 实验结果
    4.2.2 Nr4a1-/-OT-Ⅰ细胞在肿瘤中耗竭减少，增殖增加
    4.2.3 Nr4a1-/-OT-Ⅰ细胞内源性抗肿瘤能力增加，增殖增加，耗竭减少，效应功能增强
    4.2.4 慢性病毒感染后，Nr4a1-/-CD8+T细胞耗竭减少，效应功能增强
    4.2.5 慢性病毒感染后，Nr4a1-/-P14细胞增殖增加、效应功能增强、抗凋亡能力增加
    4.3 讨论
    第五章 Nr4a1介导T细胞耐受的分子机制
    5.1 材料与方法
    5.1.1 主要溶液配置
    5.1.2 293T细胞复苏、培养
    5.1.3 包装逆转录病毒
    5.1.4逆转录病毒感染na(i)ve OT-Ⅱ细胞
    5.1.5 EL4细胞复苏、培养
    5.1.6 EL4细胞过表达空载或Nr4a1质粒
    5.1.7细胞核蛋白提取
    5.1.8凝胶迁移滞后实验（EMSA）
    5.2 结果
    5.3 讨论
    全文总结
    参考文献
    文献综述:Nr4a1在T细胞中的表达与功能
    参考文献
    研究生期间发表的与课题相关的论文及获奖情况
    致谢
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转录因子Nr4a1调控T细胞耐受与耗竭的研究

王云
陆军军医大学
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引用
T细胞耐受是T细胞对自身组织抗原的一种无反应状态，进而避免自身免疫性疾病的发生。在T细胞受体（T cell receptor,TCR）信号刺激下，耐受T细胞不能有效增殖与分泌细胞因子。T细胞耐受主要由外源性机制与内源性机制共同调节。外源性机制主要由调节性T细胞（T regulatory cell，Treg）介导。内源性机制主要由转录因子NFAT、Egr2、Egr3以及E3泛素连接酶家族成员Cbl-b、Itch、GRAIL等调控。但是目前调控T细胞耐受的内源性分子机制尚不完全明确，有待进一步探究。　　在慢性感染与肿瘤中，持续抗原刺激、免疫抑制微环境以及持续激活的抑制性受体信号通路等因素，导致T细胞耗竭。耗竭T细胞分泌细胞因子障碍、增殖能力减弱，杀伤功能降低，不能有效控制感染和杀伤肿瘤。免疫检查点阻断疗法可以抑制T细胞耗竭、恢复T细胞效应功能，在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用。但是这些免疫检查点抗体有其适用条件与禁忌。需要寻找新的靶点用于增强抗原特异性T细胞功能，提高抗肿瘤能力。　　转录因子Nr4a1属于孤儿核受体Nr4a家族成员，参与调控胸腺中不成熟的CD4+CD8+T细胞阴性选择过程，介导细胞凋亡。在外周CD4+T细胞中，Nr4a1与家族成员Nr4a2、Nr4a3共同调节Treg细胞发育。Nr4a1抑制外周CD8+T细胞增殖与效应功能。　　本课题通过体外、体内耐受模型明确耐受CD4+T细胞中高表达转录因子Nr4a1。利用体内肽诱导耐受模型，小鼠结肠炎模型，E.G7荷瘤小鼠模型，LCMV病毒感染小鼠模型，考察Nr4a1对T细胞耐受与耗竭的调控作用，并探究其作用机制。本研究的方法，结果与结论作如下阐述：　　1.利用缺乏共刺激分子的抗原递呈细胞体外刺激na?ve CD4+T细胞，诱导T细胞耐受，将体外分化的耐受T细胞与Th1，Th2，Th17细胞进行基因表达谱测序，发现Nr4a1在耐受T细胞中高表达。通过体内模型诱导CD4+T细胞耐受或激活，发现Nr4a1在耐受T细胞表达明显高于激活T细胞。　　2.分选Nr4a1-/-与WT OT-Ⅱ小鼠na?ve CD4+T细胞，注射受体小鼠，利用OT-Ⅱ肽诱导T细胞耐受，发现Nr4a1-/-OT-Ⅱ细胞具有更高的比例，分泌IL-2与IFN-γ增加，细胞耐受降低,并且两组小鼠Treg细胞的产生没有差异。　　3.分选Nr4a1-/-与WT小鼠naive CD4+T细胞注射Rag1-/-小鼠，诱发小鼠结肠炎。Nr4a1-/-组小鼠体重明显下降，结肠长度缩短，HE染色显示大量炎症细胞浸润，结肠粘膜固有层浸润的CD4+T细胞明显增多，分泌IFN-γ与IL-17的细胞数目增加，并且两组小鼠Treg细胞的产生没有差异。　　4.进一步研究Nr4a1敲除对CD8+T细胞抗肿瘤能力以及耗竭的影响。受体小鼠皮下接种E.G7肿瘤细胞，待肿瘤长出后，分选WT与Nr4a1-/-OT-Ⅰ小鼠na?ve CD8+T细胞并注射荷瘤小鼠，观察肿瘤生长情况。发现Nr4a1-/-OT-Ⅰ组小鼠肿瘤明显抑制，Nr4a1-/-OT-Ⅰ细胞浸润肿瘤比例明显增加，细胞数目增多，PD-1+Tim-3+耗竭细胞比例减少，分泌IFN-γ与TNF-α的细胞数目增加，在具有免疫能力的普通小鼠与免疫缺陷的Rag1-/-受体小鼠体内均观察到这种现象。　　5.构建骨髓嵌合鼠，感染LCMV-Clone13慢性病毒，发现Nr4a1-/-CD8+T细胞PD-1+Tim-3+耗竭细胞群减少，分泌TNF-α的细胞增加。分选WT与Nr4a1-/-P14小鼠na?ve CD8+T细胞，等比例注射Rag1-/-小鼠，感染LCMV-Clone13慢性病毒，发现Nr4a1-/-P14细胞比例明显增加，Ki-67与Bcl-2表达显着增加，Tim-3、CTLA-4表达降低而PD-1、Lag3表达增加，gp33肽刺激后IFN-γ与CD107增加。　　6.通过凝胶迁移滞后实验（EMSA）发现过表达Nr4a1抑制AP-1与下游效应基因的结合。利用肽诱导的体内耐受模型，过表达AP-1家族成员C-Jun、Jun-B以及Batf的OT-Ⅱ细胞比例增加，分泌IL-2与IFN-γ增加，细胞耐受降低，与Nr4a1-/-OT-Ⅱ细胞有类似的结果。　　综上所述，得出以下结论：1.Nr4a1在耐受T细胞中高表达；2.敲除Nr4a1后CD4+T细胞增殖增加，细胞因子分泌增加；3.在肿瘤与慢性病毒感染中，Nr4a1-/-CD8+T细胞耗竭减少，增殖增加，效应功能增强；4.Nr4a1抑制AP-1与下游效应基因的结合，过表达AP-1家族成员C-Jun、Jun-B可以克服由于Nr4a1高表达而介导的T细胞耐受。这些研究结果表明，Nr4a1是调节T细胞耐受与耗竭的关键转录因子，可以作为肿瘤、慢性病毒感染以及自身免疫性疾病治疗的潜在靶点。

T细胞耐受;T细胞耗竭;转录因子Nr4a1;免疫机制

陆军军医大学

硕士

肿瘤学

卞修武

2018

中文

R392.1

2019-10-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

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