长链非编码RNA LINC00324在非小细胞肺癌中的作用和机制研究
目前为止，肺癌的发病率和死亡率在全世界范围内仍然居高不下。非小细胞肺癌（NSCLC）为其主要类型，占85％左右。近年来，肺癌的诊断和治疗尽管有了很大的进展，但是5年生存率提高有限，仍低于20%。究其原因主要是肺癌的分子机制仍不清楚。近年来研究表明，长链非编码RNA与多种肿瘤，包括肺癌的发生与进展密切相关。在本研究中，我们主要针对一个新的、在非小细胞肺癌中表达下调的长链非编码RNA（LINC00324）开展研究，验证其对非小细胞肺癌组织中的表达情况和临床意义，探讨其在非小细胞肺癌细胞生物学功能的影响和可能的作用机制，为寻找新的诊断或预后预测的分子标志物以及潜在的治疗靶标提供理论依据。 本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分 长链非编码RNA LINC00324在非小细胞肺癌和癌旁组织中的表达和意义 目的：分析LINC00324基因的生物分子信息学特征，检测非小细胞肺癌患者肺癌和癌旁正常组织中LINC00324表达情况，分析其与预后的关联，为进一步的细胞生物学实验提供线索。 方法：利用NCBI及UCSC基因浏览器，分析LINC00324的特性及编码能力；运用qRT-PCR检测非小细胞肺癌及癌旁正常组织中长链非编码RNA LINC00324的表达水平；运用Kaplan-Meier分析TCGA数据库中的肺癌信息，验证LINC00324在非小细胞肺癌中的表达情况及其与患者预后的关系。 结果：1.LINC00324属于基因间长链非编码RNA，位于17p13.1染色体上，包含三个外显子，全长2115nt。并且LINC00324的编码潜力很低，符合长链非编码RNA的特征。 2.通过65对非小细胞肺癌及癌旁正常组织进行qRT-PCR的结果分析显示，LINC00324在肺癌组织中表达显著下调（P＜0.05）。 3.使用Kaplan-Meier生存分析对数据库信息进行分析表明，LINC00324在非小细胞肺癌中的低表达与较差的总生存显著相关（HR=0.44，CI=0.37-0.52，P＜0.01）。多因素COX回归分析结果也显示LINC00324的低表达与非小细胞肺癌较差的总生存率显著相关（HR=0.742，CI=0.577-0.954，P＜0.05）。 结论：LINC00324作为一个基因间长链非编码RNA，位于17p13.1染色体上。LINC00324的表达量在非小细胞肺癌组织中显著降低，患者的预后较差与其低表达相关。 第二部分 长链非编码RNA LINC00324在非小细胞肺癌细胞生物学行为中的作用 目的：观察LINC00324对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响。 方法：设计构建LINC00324的siRNA以及过表达质粒，通过转染非小细胞肺癌细胞建立LINC00324的干扰和过表达模型。通过Cell counting kit-8（CCK-8）实验，观察LINC00324对非小细胞肺癌细胞增殖的影响。使用含与不含基质胶的Transwell小室进行细胞迁移和侵袭实验观察LINC00324对非小细胞肺癌细胞迁移、侵袭能力的影响。通过流式细胞技术检测LINC00324对细胞凋亡影响，通过体内成瘤实验和尾静脉注射Balb/c小鼠转移瘤实验，观察LINC00324对非小细胞肺癌细胞体内成瘤和转移的影响。 结果：1.在不同非小细胞肺癌细胞株中LINC00324基因表达水平不同，在SPCA1和H1299细胞系中表达相对较高，而在A549和H460细胞系中表达相对较低。 2.细胞生物学行为实验表明，干扰细胞内LINC00324表达可以促进SPCA1和H1299细胞的增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡。相反，通过质粒转染过表达LINC00324后，可以抑制A549和H460细胞的增殖、迁移、侵袭并促进凋亡。 3.皮下成瘤显示，在裸鼠体内LINC00324可抑制非小细胞肺癌细胞生长；转移瘤实验显示，在Balb/c小鼠体内LINC00324可以抑制非小细胞肺癌细胞的转移。 结论：长链非编码RNA LINC00324在非小细胞肺癌中发挥抑癌的作用，可以抑制非小细胞肺癌的发生发展。 第三部分 长链非编码RNA LINC00324在非小细胞肺癌中的分子机制 目的：探讨LINC00324对肺癌细胞生物学行为影响的分子调控机制。 方法：质核分离及RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）实验观察LINC00324在非小细胞肺癌细胞的亚细胞定位。运用RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP）实验，验证LINC00324与HuR蛋白结合互相作用。利用生物学功能回复实验研究LINC00324能否通过与HuR结合调控非小细胞肺癌细胞的生物学功能。通过Western blot验证LINC00324与HuR蛋白表达量之间的关系。 结果： 1.质核分离及RNA-FISH实验显示，LINC00324在非小细胞肺癌细胞中主要在细胞质中分布。 2.Western blot实验显示，干扰非小细胞肺癌细胞内LINC00324表达可以增加HuR蛋白的表达。相反的，过表达非小细胞肺癌细胞内的LINC00324可以减少HuR蛋白的表达。 3.RIP实验显示，LINC00324可以与HuR蛋白结合。 4.干扰HuR的表达可以逆转干扰LINC00324表达对非小细胞肺癌细胞H1299促进增殖的作用，也可以逆转干扰LINC00324对非小细胞肺癌细胞促进迁移和侵袭的作用。 结论：LINC00324可以与HuR蛋白结合，通过HuR蛋白的调控作用在非小细胞肺癌的发生发展中发挥其抑癌作用。 总结论：长链非编码RNA LINC00324可以通过HuR蛋白的调控作用在非小细胞肺癌的发生发展中发挥其抑癌作用，并且与肺癌患者的预后显著相关。
非小细胞肺癌;长链非编码RNA;生物学行为;分子机制;HuR蛋白
陆军军医大学
硕士
流行病学与卫生统计学
李亚斐
2019
中文
R734.2;R730.3
2019-10-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）