血小板微粒促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变形成及其对内皮细胞功能的影响
研究目的： 急性心脑血管事件是目前世界范围内发病率和死亡率最高的疾病之一，其主要病理基础是动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）病变的形成及AS斑块的破裂。AS是一个慢性炎症过程，脂质和免疫细胞血管壁的积聚、炎症介质的释放增加及粥样斑块的形成是其主要特征。AS进展过程中内皮功能障碍导致内皮损伤加剧，斑块内脂质核心增大，纤维帽变薄，斑块部位炎症加重、斑块内不成熟血管的新生及出血等因素导致斑块稳定性降低，不稳定的AS斑块破裂后将血管壁结构和坏死脂质核心暴露于循环，并释放大量的促凝血物质，引起凝血系统和血小板的激活，被招募的血小板在斑块破裂部位活化并形成血栓，导致管腔闭塞，造成急性心脑血管事件的发生。研究表明，血小板除了具有正常的凝血功能外，还是参与到AS形成和发展的重要的炎症和免疫细胞。血小板在被不同情况激活或凋亡时可释放出大量的血小板微粒(platelet microparticles，PMPs)，PMPs直径大小为0.1～1.0μm，约占循环细胞微粒总量的70％～90%，PMPs作为载体，可携带血小板激活时产生糖蛋白、P-选择素、生物活性脂类和miRNA等前往在AS血管病变部位继续发挥更为持久和广泛的病理生理作用。本课题组前期研究发现：1、金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白5（staphylococcal superantigen-like protein5,SSL5）激活产生的PMPs可以促进单核细胞中炎症因子（IL-1β、TNF-α、MCP-1及MMP-9）的表达,加重AS斑块部位炎症反应；2、PMPs除依赖于其携带的多种生长因子外，还可通过促进内皮细胞表达和分泌MMP-2/9实现其促血管新生效应；其中MMP-2的作用更明显。因此，我们推测PMPs在体内外实验中可能通过斑块部位炎症进展、斑块内血管新生、内皮功能障碍等途径来促进AS斑块病变发展和进一步导致斑块失稳定，也为更加深入了解PMPs在体内所发挥的重要功能和在心血管疾病中的作用奠定基础。 研究方法： 1.体外制备二磷酸腺苷（adenosine diphosphate,ADP）激活的C57BL/6小鼠来源的PMPs，采用流式细胞术进行鉴定，BCA法进行定量。购买8周龄雄性ApoE-/-小鼠40只，均持续以高脂饲料饲养，4周后按随机数字表法分入以下4组（每组10只）：①PBS溶液对照组（PBS组）；②不含PMPs的上清液对照组（SUP组）；③低剂量PMPs组（LDP组，每次给予PMPs的量为1×107个）；④高剂量PMPs组（HDP组，每次给予PMPs的量为3×107个）。上述各组每周经尾静脉注射1次，每次注射体积均为200μL，共8次。每周监测小鼠体质量1次。于末次注射后第7天，小鼠行安乐死，并采集血液标本用于检测血常规、血脂、肝肾功能、CRP、IL-1β和TNF-α水平；取主动脉和头臂干动脉用于AS方面的病理检测，包括油红O染色、H&E染色、Masson染色、免疫组化检测（CD68、MMP-9、α-SMA），对AS斑块的形成及稳定性进行评估。 2.培养人微血管内皮细胞（Human endothelial cells，HMECs），选择空白对照（Con）（Tyrode's溶液），溶剂对照（Sup）（不含PMPs的上清液），利用ELISA检测PMPs对HMECs内皮功能相关因子PGI2、TXA2的表达，采用免疫荧光探针检测方法HMECs细胞中NO的表达，采用Western Blot检测磷酸化eNOS和ET-1的表达,研究PMPs对HMECs内皮细胞功能的影响。 研究结果： 1.PMPs对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成及稳定性的影响。 ①PMPs对小鼠体质量、血常规(WBC、RBC、PLT、HGB)、血脂（TG、TCH、LDL、HDL）、肝功（ALT、AST）、肾功能（UN、Cr）等指标没有影响。 ②PMPs组较空白对照组和SUP组：可促进小鼠AS斑块形成、增加斑块内脂质核心占斑块总面积的比例、提高斑块内巨噬细胞浸润，增加斑块内MMP-9的表达，降低斑块部位的胶原含量和平滑肌细胞含量。 ③PMPs组较空白对照组和SUP组，显著上调血清CRP、IL-1β、TNF-α表达水平。 2.PMPs促进HMECs中TXA2、ET-1的表达，抑制了p-eNOS的生成，降低了NO、PGI2的表达量。 研究结论： PMPs可促进高脂饲养ApoE-/-小鼠AS斑块的形成以及斑块局部的巨噬细胞浸润和炎症反应，减少其中胶原和平滑肌细胞的含量，从而进一步降低斑块的稳定性。PMPs促进HMECs中TXA2、ET-1的表达，抑制了eNOS的磷酸化，降低了NO、PGI2的表达量，显示其造成了HMECs细胞内皮功能损伤的加重。本研究发现了PMPs可在小鼠体内促进动脉粥样硬化病变发展和降低斑块稳定性，细胞实验中PMPs可导致微血管内皮细胞功能损伤加重，也以此更加全面地了解和认识PMPs在心血管相关疾病中的作用，并为其防治奠定基础。
动脉粥样硬化病;发病机制;内皮细胞功能;血小板微粒
陆军军医大学
硕士
内科学(心血管病)
胡厚源
2019
中文
R543.502
2019-10-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）