内质网应激-自噬在烧伤后肠屏障损害中的作用机制及其对肠道护理的启示
研究目的： 早期及时有效的肠道护理干预措施对严重烧伤患者的救治极其重要.肠黏膜屏障功能损害和肠道通透性增加是严重烧伤或烧放复合伤后肠道细菌移位、脓毒症及死亡的重要影响因素,因此肠黏膜屏障功能的恢复是严重烧伤患者早期肠道护理中的重要内容.既往的研究表明,严重烧伤早期机体低血容量性休克引起全身性组织器官的缺血缺氧性损害,而过度且持久的缺血缺氧性损害是肠黏膜屏障功能损害的重要因素之一.紧密连接(TJ)位在于肠黏膜细胞膜的边缘和顶部,是肠黏膜屏障中的重要组成之一,在维持肠道通透性中发挥十分重要的作用.由于影响烧伤后肠黏膜紧密连接屏障损害的因素极其复杂,因此目前具体的分子机制仍尚未完全清楚.已有研究表明,内质网应激与自噬相互作用,并且与炎症性肠病的发生与发展有着密切的联系.当肠上皮细胞内质网稳态未能通过未折叠蛋白反应(UPR)得以重建,过度或持久内质网应激则能激活自噬,导致自噬性细胞死亡,从而造成肠黏膜损害.因此,假设严重烧伤通过改变肠黏膜内质网应激水平引起自噬,致使紧密连接蛋白的表达和分布发生变化,导致肠黏膜紧密连接屏障损害和通透性增加.本课题通过建立严重烧伤小鼠模型和体外建立单层肠上皮细胞模型,探究内质网应激-自噬通路在严重烧伤后肠黏膜紧密连接屏障损害中的作用及其机制,阐明严重烧伤后肠黏膜紧密连接屏障损害的发生机制,进一步明确了肠黏膜屏障功能在肠道护理中的重要作用,为严重烧伤及危重症患者肠道护理提供了新的指导思路,为探索精准有效的医疗与护理措施提供新的干预靶点与思路. 研究方法： 1.健康成年C57BL/6小鼠随机分为对照组和烧伤组,烧伤小鼠建立30％TBSAⅢ度烧伤模型,观察时相点为1h、2h、6h、12h及24h. 2.健康成年C57BL/6小鼠随机分为对照组、Tm组(1.0mg/kg)、Tg组(300ng/kg)、4-PBA组(80mg/kg)、单纯烧伤组、烧伤+Tm组(1.0mg/kg)、烧伤+Tg组(300ng/kg)以及烧伤+4-PBA组(80mg/kg),所有烧伤小鼠均建立30%TBSAⅢ度烧伤模型,时相点为烧伤后6h. 3.健康成年C57BL/6小鼠随机分为对照组、RAPA组(4mg/kg)、3-MA组(15mg/kg)、单纯烧伤组、烧伤+RAPA组(4mg/kg)以及烧伤+3-MA组(15mg/kg),所有烧伤小鼠均建立30%TBSAⅢ度烧伤模型,时相点为烧伤后6h. 4.将单层Caco-2肠上皮细胞随机分为对照组和缺氧组,缺氧组细胞进行缺氧处理(1%O2、5%CO2和94%N2混合气体培养),时相点为1h、2、6h、12h及24h. 5.将单层Caco-2细胞随机分为常氧组、常氧+Tm组(5μg/mL)、常氧+Tg组(1μmol/L)、常氧+4-PBA组(2mmol/L)、缺氧组、缺氧+Tm组(5μg/mL)、缺氧+Tg组(1μmol/L)以及缺氧+4-PBA组(2mmol/L).时相点为缺氧后6h. 6.将单层Caco-2细胞随机分为常氧组、常氧+RAPA组(50nmol/L)、常氧+3-MA组(10mmol/L)、缺氧组、缺氧+RAPA组(50nmol/L)及缺氧+3-MA组(10mmol/L).时相点为缺氧后6h. 7.用异硫氰酸荧光素葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran,FITC-dextran)示踪法检测小鼠肠道及单层Caco-2细胞通透性. 8.用间接免疫荧光法分别检测肠黏膜组织ZO-1蛋白和LC3B蛋白的表达与分布,以及单层Caco-2细胞TJ蛋白ZO-1、occludin和claudin-1蛋白的表达与分布,在激光共聚焦显微镜下观察并拍照. 9.对小鼠肠黏膜组织进行HE染色,在光镜下观察其组织结构的变化并拍照. 10.透射电镜分别检测肠黏膜上皮细胞和单层Caco-2细胞中的自噬小体并拍照. 11.用电阻测定仪检测单层Caco-2细胞跨细胞电阻(transepithelial electrical resistance,TER). 12.Western blot法检测肠黏膜组织及Caco-2细胞ZO-1、occludin、claudin-1、claudin-2、BIP、CHOP、XBP1、XBP1s、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1、Atg5和P62蛋白表达的变化. 13.GFP-LC3B融合蛋白示踪单层Caco-2细胞自噬体的形成情况. 研究结果： 1.严重烧伤导致小鼠肠道通透性增加,肠黏膜TJ屏障损害以及ERS和自噬水平显著增强. (1)严重烧伤小鼠肠道通透性显著升高. (2)严重烧伤小鼠肠黏膜TJ蛋白ZO-1、occludin,claudin-1蛋白表达下降,claudin-2蛋白表达升高.且ZO-1蛋白的分布发生明显改变. (3)光镜下观察发现,严重烧伤小鼠肠黏膜组织结构明显受损. (4)严重烧伤小鼠肠黏膜内质网应激水平明显增强. (5)严重烧伤鼠肠黏膜自噬水平发生显著增强. (6)严重烧伤小鼠肠黏膜PI3K/AKT/mTOR信号通路明显受到抑制. 2.内质网应激-自噬通路激活参与了严重烧伤小鼠肠黏膜TJ屏障功能损害的发生. (1)内质网应激特异性诱导剂Tm与Tg提高了烧伤后小鼠肠黏膜内质网应激水平,并进一步增强严重烧伤小鼠肠黏膜自噬水平以及PI3K/AKT/mTOR信号通路的下调;内质网应激特异性抑制剂4-PBA明显降低了严重烧伤小鼠肠黏膜内质网应激和细胞自噬水平,且上调PI3K/AKT/mTOR信号通路. (2)Tm与Tg均显著促进严重烧伤小鼠肠道通透性的进一步增加,明显加重了肠黏膜屏障功能的损害,4-PBA则显著降低了烧伤小鼠肠道通透性,明显坚强了严重烧伤所致肠黏膜屏障功能损害. (3)自噬特异性诱导剂RAPA明显增强了严重烧伤小鼠肠黏膜细胞自噬水平;自噬特异性抑制剂3-MA则明显抑制了严重烧伤小鼠肠黏膜细胞自噬水平. (4)RAPA促使严重烧伤小鼠肠道通透性的进一步增加,加重肠黏膜屏障功能的损害;3-MA则显著降低了严重烧伤小鼠肠道通透性,明显减轻了严重烧伤所致的肠黏膜屏障功能损害. 3.内质网应激-自噬通路激活参与了缺氧引起的肠上皮细胞TJ屏障功能损害. (1)缺氧引起单层Caco-2细胞TER降低,通透性增加. (2)缺氧使单层Caco-2细胞TJ蛋白ZO-1、occludin与claudin-1蛋白表达下降,且分布发生明显改变. (3)缺氧引起单层Caco-2细胞内质网应激和自噬水平均显著增加. (4)内质网应激特异性诱导剂Tm和Tg均明显增强缺氧单层Caco-2细胞内质网应激和自噬水平,进一步下调缺氧单层Caco-2细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路;内质网应激特异性抑制剂4-PBA则显著抑制缺氧单层Caco-2细胞内质网应激与自噬水平,上调缺氧单层Caco-2细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路. (5)Tm与Tg均引起缺氧单层Caco-2细胞TER进一步下降,通透性进一步增加,加重缺氧单层Caco-2细胞屏障功能损害;4-PBA显著增加缺氧单层Caco-2细胞TER,降低通透性,明显减轻缺氧单层Caco-2细胞屏障功能损害. (6)自噬特异性诱导剂RAPA增强缺氧单层Caco-2细胞自噬水平,自噬特异性抑制剂3-MA降低缺氧单层Caco-2细胞自噬水平. (7)RAPA引起缺氧单层Caco-2细胞TER进一步降低,通透性进一步增加,加重屏障功能损害;3-MA显著增加缺氧单层Caco-2细胞TER,降低通透性,明显减轻缺氧所致单层Caco-2细胞肠屏障功能损害. 研究结论： 1.严重烧伤后小鼠肠道通透性增加,肠黏膜TJ屏障功能损害,且肠黏膜内质网应激与自噬水平均显著增加. 2.严重烧伤引起的的内质网应激通过PI3K/AKT/mTOR信号通路激活细胞自噬,且内质网应激和自噬的激活均参与了严重烧伤小鼠肠黏膜TJ屏障功能损害的发生. 3.缺氧引起单层Caco-2细胞TER明显降低,通透性增加,肠上皮细胞TJ屏障功能损害,且细胞内内质网应激和自噬水平均显著增加. 4.缺氧引起的单层Caco-2细胞内质网应激通过PI3K/AKT/mTOR信号通路激活自噬,且内质网应激-自噬通路的激活参与了单层Caco-2细胞TJ屏障功能损害的发生. 5.本研究进一步证明了严重烧伤患者早期、有效用氧和早期胃肠道营养支持的重要性,为护理人员进一步研究严重烧伤患者早期精准有效护理举措提供了新的实验依据. 6.进一步明确了严重烧伤早期肠黏膜屏障功能在肠道护理中的重要性,为严重烧伤患者肠道护理提供了新的思考点,为下一步探索精准有效的医疗与护理措施提供新的干预靶点及研究思路.
肠屏障损害;护理干预;内质网应激;细胞自噬;营养支持
陆军军医大学
博士
护理学
任辉
2019
中文
R574;R473.5
2019-10-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）