广谱活性氧清除性纳米粒的构建及其防治炎症和氧化应激相关疾病的研究
目的： 炎症是人体基于不同的刺激而产生的自动防御性反应，目前用于临床治疗的抗炎药物以传统的非甾体抗炎药或糖皮质激素等为主，但是在使用过程中容易导致各种副反应的发生。在各种急慢性炎症疾病的病理过程都伴随着大量活性氧生成，会导致氧化应激失衡和机体损伤。因此，开发具有抗炎和抗氧化应激功能的药物有重要的临床意义。尽管目前有许多颇具潜力的抗氧化和自由基清除制剂用于炎症和氧化应激相关疾病的临床前治疗，但是由于其有限的活性氧清除能力或非特异性的体内分布，导致这些制剂的临床转化依然面对着巨大的挑战。 针对上述问题，本课题期望通过构建多种活性氧同时清除的纳米药物来治疗炎症和氧化应激相关疾病。为了验证该假设，通过在环糊精(β-CD)的骨架上共价连接Tempol(Tpl)以及苯硼酸频哪醇酯(PBAP)，成功合成了具有广谱活性氧清除特性的新型可降解纳米材料(TPCD)，并利用其制备形成纳米粒(TPCD NP)。考察了TPCD NP在各种急慢性炎症和氧化应激相关疾病中的疗效，同时验证多种活性氧同时清除的策略与单一或部分活性氧清除的策略相比较，在体内外模型中是否具有优势。 方法： 1.TPCD的合成及表征 Tpl首先被CDI活化得到Tpl-CDI。将Tpl-CDI、β-CD及4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于无水DMSO，室温搅拌得到TCD。根据同样的方法，得到被CDI活化的PBAP。然后将PBAP-CDI、TCD及DMAP溶于无水DMSO中。产物处理后得到广谱ROS清除性纳米材料TPCD。通过核磁共振光谱(1H NMR)、红外光谱(FT-IR)、电子自旋共振光谱(EPR)和紫外(UV)来确定TPCD的结构，并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)测定材料的分子量。 2.TPCD水解产物的鉴定 将TPCD和1.0mM H2O2共孵育后得到的水解产物冻干后进行核磁和MALDI-TOF质谱的检测。然后将TPCD和不同浓度的H2O2反应，利用高效液相色谱分析水解后得到的产物，确定TPCD可能的水解机制。 3.TPCD的清除不同的活性氧 采用DPPH·来考察TPCD清除自由基的能力；采用超氧阴离子试剂盒以及双氧水试剂盒来分别检测TPCD清除超氧阴离子和双氧水的能力；次氯酸根的清除能力通过本课题组之前报道的化学发光探针进行分析。另外通过同样的方法，分别比较不同的材料(TPCD，TCD和PCD)广谱清除活性氧的效率。 4.TPCD纳米粒的制备与表征 首先将卵磷脂、DSPE-PEG溶于水相，载体材料TPCD溶于甲醇中，剧烈搅拌下将有机相缓慢滴加于水相，冻干后得到纳米粒(TPCD NP)。通过激光粒度仪测定不同纳米粒的粒径大小及其分布。采用透射电子显微镜(TEM)和场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)来观察不同纳米粒的形貌。 5.TPCD NP的活性氧响应性水解 将TPCD NPs和不同浓度的双氧水共孵育，在不同的时间点测量该溶液的透光率，计算得到纳米粒的水解程度。另外与不同浓度双氧水水解后的纳米粒的形貌、粒径分布和Zeta电势也分别采用TEM和DLS进行了测量。 6.细胞摄取实验 小鼠巨噬细胞RAW264.7与Cy5/TPCD NP共培养不同的时间后，利用溶酶体探针染色，4％多聚甲醛固定，DAPI染细胞核。最后采用激光共聚焦观察纳米粒的细胞吞噬情况。另外，RAW264.7细胞中Cy5/TPCD NP的荧光强度也通过流式细胞仪进行分析，同时考察纳米粒被细胞摄取的时间依赖性和剂量依赖性。 7.TPCD NP保护过量双氧水导致的细胞凋亡 采用膜联蛋白V/PI试剂盒考察了TPCD NP对高浓度双氧水导致的巨噬细胞的凋亡的保护作用。另外在同样的条件下，比较具有广谱活性氧清除性能的TPCD NP与其他单一或部分活性氧清除性纳米粒或小分子对照组的活性。 8.体内足趾肿胀模型的疗效研究 在SD大鼠的足趾局部注射2wt%的角叉菜胶的方法构建大鼠足趾肿胀模型。分别采用两种剂量的TPCD NP(1.0和5.0mg/kg)以及小分子抗氧化剂Tpl在造模30分钟后进行干预，最后在不同的时间点通过足趾肿胀仪测定大鼠足趾的体积，计算得到不同处理方式大鼠的足趾肿胀程度。 9.TPCD NP对腹膜炎的疗效评价 通过腹腔注射酵母多糖构建BALB/c小鼠急性腹膜炎模型。分别在造模30分钟后腹腔给予两种剂量的TPCD NP(0.1和1.0mg/kg)以及小分子抗氧化剂Tpl进行治疗，6小时后处死小鼠取腹腔灌洗液，利用ELISA试剂盒检测其中MPO、H2O2、TNF-α和IL-1β的含量。在相同的实验条件下，另外比较具有广谱活性氧清除性能的TPCD NP与其他单一或部分活性氧清除性纳米粒或小分子对照组(PCD NP、TCD、Tpl和Tpl/HMP)对腹膜炎的治疗效果。 结果： 1.以β-CD为骨架，通过共价键合Tpl和PBAP，合成了具有广谱ROS清除特性的材料TPCD。在双氧水存在条件下，TPCD能够完全水解生成可溶于水的小分子Tpl，对羟基苄醇和硼酸酯。通过高效液相色谱分析表明一个β-CD骨架分子上大约共价键结合了2个Tpl分子和5个PBAP单元。另外，TPCD能够有效清除自由基、超氧阴离子、过氧化氢(H2O2)和次氯酸根等不同种类的ROS。 2.通过纳米沉淀/自组装的方法可以制备得到TPCD纳米粒。TPCD NP的水解程度随着双氧水浓度的升高而增加，但是在不含双氧水的PBS溶液中纳米粒的水解程度可以忽略不计。 3.体外细胞实验表明，巨噬细胞RAW264.7能够迅速而有效地摄取TPCD NP。通过激光共聚焦显微镜和流式检测均表明细胞对纳米粒的吞噬作用呈时间和剂量依赖性。另外，TPCD NP能有效清除活性氧，明显抑制氧化应激介导的细胞凋亡，并且其效果优于其它单一或部分活性氧清除性对照组。 4.在小鼠足趾肿胀模型中，采用5.0mg/kgTPCD NP干预可显著抑制足趾水肿程度，与相同剂量的游离Tpl或低剂量(1.0mg/kg)纳米粒相比治疗效果更佳。 5.TPCD NP能够有效降低腹膜炎模型鼠体内炎症因子和氧化应激相关指标的含量。而高剂量的Tpl组的治疗效果与低剂量的TPCD NP相当。同时，TPCD NP与其它单一或部分活性氧清除性对照组相比治疗效果是最优的。 6.TPCD NP能有效地靶向急性肺损伤小鼠的肺部组织。经过TPCD NP治疗后肺部组织的干湿比明显降低，同时肺部灌洗液中氧化应激和炎症因子的水平也显著性地减少。此外，TPCD NP尾静脉给药后可缓解模型鼠肺部H&E病理切片的组织学异常。与上述腹膜炎模型类似，TPCD NP与其它对照组相比也显示出更有益的结果。 7.TPCD NP也可作为一种治疗慢性炎症哮喘的纳米药物，能够有效降低肺部灌洗液中的氧化应激和炎症因子水平，其疗效优于同等剂量的Tpl。另外，在哮喘模型中，TPCD NP依然表现出了比单一或部分活性氧清除性对照组更优越的疗效。 8.在APAP导致的脏器损伤模型中，TPCD NP能够降低血清中肝肾功相关指标的含量，且呈剂量依赖性。与模型组相比，肝脏组织中炎症因子和氧化应激相关指标的表达在尾静脉给药治疗后也显著减少。与上述急慢性炎症类似，TPCD NP对脏器损伤的治疗效果也优于其它单一或部分活性氧清除性对照组。 9.在体内外初步的安全性评价实验中，TPCD NP对RAW264.7和HepG2细胞的毒性可忽略不计。另外，在体外溶血实验中发现，即使在相对较高浓度的TPCD NP与红细胞共孵育的条件下，溶血程度也小于1%。最后，在急性毒性考察中，通过口服腹腔、静脉注射1000mg/kg的TPCD NP后，小鼠的体重、脏器指数、血常规和肝肾功与正常小鼠相比无明显差异。同样，小鼠主要脏器的H&E切片也没有发现明显病变。 结论： 1.本课题通过β-CD与Tpl和PBAP的共价键合，成功构建了一种SOD/过氧化氢酶模拟性的广谱活性氧清除材料TPCD。并以此构建了具有抗氧化应激和和抗炎功能的纳米药物TPCD NP。 2.在体外细胞实验中，TPCD NP能够迅速被摄取到细胞内部，抑制高浓度双氧水诱导的巨噬细胞凋亡。 3.在几种急慢性炎症模型(包括足趾肿胀、腹膜炎、急性肺损伤和哮喘)中，TPCD NP能够有效地减轻氧化应激，抑制病变组织或器官的炎症反应。此外，TPCD NP能够通过消除过量产生的ROS，显著缓解氧化应激介导的脏器损伤。在所有这些疾病模型中，TPCD NP治疗比单一或部分活性氧清除性对照药物表现出了更优的效果。 4.体内外初步安全性评价表明，TPCD NP可以作为一种安全的纳米治疗药物。 因此，TPCD NP作为一种有效、安全的纳米药物，在炎症和氧化应激相关疾病的治疗中值得进一步拓展。TPCD NP的性能可通过表面的修饰进一步增强(如增加靶向病变组织或线粒体的主动靶向单元)，也可以负载其他抗炎药物提高其药理活性。
活性氧清除性纳米药物;抗炎功能;氧化应激;细胞凋亡;安全性
陆军军医大学
博士
药剂学
张建祥
2019
中文
R978
2019-10-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）