Sirt1调节自噬和凋亡参与心肌慢性缺氧适应的作用研究
研究目的: 本项目拟在临床心肌标本检测慢性缺氧条件下凋亡和自噬相关蛋白以及Sirt1的表达变化;建立慢性缺氧细胞模型,应用腺病毒Ad-Sirt1和Ad-Sh-Sirt1实现Sirt1的过表达和干扰。在细胞水平检测Sirt1对缺氧心肌细胞自噬和凋亡的影响,以及AMPK和IRE1α信号通路关键蛋白的调控作用。建立慢性缺氧小鼠模型,运用Sirt1激动剂SRT1720和抑制剂EX-527检测其对缺氧小鼠心肌自噬和凋亡的影响。 研究方法: 1.人心肌标本的收集:收集紫绀组和非紫绀组患者右室流出道组织:紫绀组为法洛四联症患者,非紫绀组为室间隔缺损合并右室流出道狭窄患者。提取组织蛋白,采用Western blot检测自噬(LC3-Ⅱ和p62),凋亡(cleaved Caspase3和Bcl2)相关蛋白和Sirt1在两组患者心肌标本中的表达情况。 2.探索Sirt1在缺氧H9C2细胞自噬中的作用及调控机制: 2.1建立慢性缺氧细胞模型:将无血清培养基饥饿过夜的H9C2心肌细胞置于O21%,CO25%,N294%的细胞培养箱中培养24h,建立慢性缺氧细胞模型;常氧组氧浓度为21%。 2.2检测Ad-Sirt1过表达和Ad-Sh-Sirt1干扰的效果,Ad-LacZ作为对照,并检测Sirt1对基础自噬的影响。 2.3将细胞分为常氧+Ad-LacZ组,缺氧+Ad-LacZ组,常氧+Ad-Sh-Sirt1组,缺氧+Ad-Sh-Sirt1组,检测LC3-Ⅱ和p62的表达变化。 2.4将细胞分为常氧+Ad-LacZ组,缺氧+Ad-LacZ组,缺氧+Ad-Sirt1组,缺氧+Ad-Sh-Sirt1组,检测各组心肌细胞p-AMPK和AMPK蛋白表达情况。 2.5将细胞分为常氧+Ad-LacZ组,缺氧+Ad-LacZ组,缺氧+Ad-Sirt1组,缺氧+Ad-Sirt1+Compound C组,检测各组心肌细胞LC3-Ⅱ和p62蛋白表达情况。 3.研究Sirt1在慢性缺氧心肌细胞凋亡中的作用 3.1将细胞分为常氧+Ad-LacZ组,缺氧+Ad-LacZ组,缺氧+Ad-Sirt1组,缺氧+Ad-Sh-Sirt1组。Western blot检测各组心肌细胞cleaved Caspase3和Bcl2蛋白表达情况;流式细胞仪检测各组细胞凋亡的变化情况。Western blot检测过表达和干扰Sirt1后,IRE1α和p-IRE1α蛋白的表达水平的变化。 3.2运用慢病毒Lv-Sh-IRE1α干扰IRE1α表达,Ad-IRE1α过表达IRE1α,Western blot验证效率。将细胞分为Lv-Sh-Scramble+常氧组,Lv-Sh-Scramble+缺氧组,Lv-Sh-IRE1α+常氧组,Lv-Sh-IRE1α+缺氧组,Ad-LacZ+常氧组,Ad-LacZ+缺氧组,Ad-IRE1α+常氧组,Ad-IRE1α+缺氧组,共计8组。Western blot检测各组凋亡相关蛋白cleaved Caspase3和Bcl2蛋白的表达情况。Western blot检测各组JNK、c-jun、NF-κB p65的表达及磷酸化。 3.3将细胞分为Ad-LacZ+缺氧组,Ad-IRE1α+缺氧组,Ad-Sirt1+缺氧组,Ad-IRE1α+Sirt1+缺氧组,Western blot检测各组心肌细胞cleaved Caspase3和Bcl2蛋白表达情况。Western blot检测各组JNK、c-jun、NF-κB p65的表达及磷酸化。 4.研究Sirt1激动剂和抑制剂在慢性缺氧小鼠心肌细胞自噬和凋亡中的影响。 4.1将8-10周龄的雄性C57BL/6J小鼠分为常氧+DMSO组,缺氧+DMSO组,缺氧+SRT1720组,缺氧+EX-527组(每组10只)。缺氧组小鼠饲养于Ruskinn低氧工作站,氧浓度为10%。常氧组氧浓度为21%。SRT1720为Sirt1激动剂,剂量为50mg/kg/d,EX-527为Sirt1的抑制剂,剂量为10mg/kg/d,给药方式为腹腔注射。缺氧饲养时间为2周。 4.2待缺氧时间结束后,检查小鼠血红蛋白浓度和红细胞比容评估缺氧效果,同时收集小鼠心脏。免疫荧光检查常氧组和缺氧组HIF-1α表达情况。 4.3Western blot检测各组小鼠心肌组织中Sirt1、Acet-p53、p53蛋白的表达情况。 4.4Western blot检测各组小鼠心肌组织中LC3-Ⅱ、p62、p-AMPK、AMPK蛋白的表达情况。免疫荧光检测各组LC3-B的表达变化。 4.5Western blot检测各组小鼠心肌cleavedCaspase3、Bcl2、p-IRE1α、IRE1α蛋白的表达情况。TUNEL法检测各组小鼠心肌凋亡比例的变化。 研究结果: 1.Western blot结果显示紫绀组患者心肌中Sirt1的表达显著高于非紫绀组。同非紫绀组相比,紫绀组中LC3-Ⅱ表达明显增加而p62表达明显降低,此外紫绀组中cleaved Caspase3表达明显增加而Bcl2表达明显降低。 2.同对应的Ad-LacZ组相比,Ad-Sirt1组中明显Sirt1的表达量明显上调,而Ad-Sh-Sirt1组则显著降低。Western blot检测自噬相关蛋白表达,结果表明在Ad-Sirt1组中LC3Ⅱ的表达上调,而p62的表达明显下调。同缺氧对照组相比,Ad-Sh-Sirt1+缺氧组中LC3-Ⅱ的表达降低,p62的表达增加。同缺氧对照组相比,Ad-Sirt1+缺氧组p-AMPK/AMPK比值增加,Ad-Sh-Sirt1+缺氧组p-AMPK/AMPK比值降低。同缺氧对照组相比,Ad-Sirt1+缺氧组中LC3-Ⅱ的表达增加,p62的表达减少,当AMPK抑制剂Compound C加入后Sirt1的促自噬作用被抑制。 3.利用流式细胞仪检测缺氧心肌凋亡,结果显示同缺氧对照组相比,Ad-Sirt1组的凋亡细胞所占比值明显减少,而在Ad-Sh-Sirt1组中显著增加。Western blot法检测凋亡相关蛋白,结果表明Ad-Sirt1组中cleaved Caspase3表达显著下调,Bcl2表达显著上调,而在Ad-Sh-Sirt1组中结果相反。同对应的缺氧对照组相比,Ad-Sirt1+缺氧组p-IRE1α/IRE1α比值明显降低,Ad-Sh-Sirt1+缺氧组p-IRE1α/IRE1α比值明显增加。同缺氧对照组相比,IRE1α过表达组中cleaved Caspase3表达增加,Bcl2的表达降低,而在IRE1α干扰组中cleaved Caspase3表达减少,Bcl2的表达增加。进一步的结果表明同对应的缺氧对照组相比,IRE1α过表达组中p-JNK/JNK、p-cjun/cjun和p-p65/p65NF-κB的比值明显增加,而在IRE1α干扰组中p-JNK/JNK、p-cjun/cjun和p-p65/p65NF-κB的比值明显减少。Western blot结果表明,同Ad-LacZ+缺氧组相比,Ad-IRE1α+缺氧组中p-JNK/JNK、p-cjun/cjun和p-p65/p65NF-κB的比值明显增加,而共同过表达Sirt1后上述比值降低。 4.和常氧组小鼠相比,缺氧组小鼠中血红蛋白和红细胞比容明显增加,HIF-1α免疫荧光强度明显增加。同缺氧组小鼠相比,干扰组(EX-527)中Sirt1蛋白的表达明显降低,acetyl-p53/p53的比值明显增加,而激动组(SRT1720)中Sirt1蛋白的表达明显增加,acetyl-p53/p53的比值明显降低。同缺氧组小鼠相比,干扰组中p-AMPK/AMPK的比值和LC3-Ⅱ表达明显降低,p62表达水平明显增加,而在激动组中p-AMPK/AMPK的比值和LC3-Ⅱ表达明显增高,而p62表达水平明显降低。LC3-B免疫荧光染色的结果表明同缺氧组相比,EX-527组中LC3-B免疫荧光强度明显降低,SRT1720组中LC3-B的免疫荧光强度明显增强。Western blot结果表明同缺氧组小鼠相比,EX-527组中p-IRE1α/IRE1α的比值和cleaved Caspase3表达增加,Bcl2表达降低;而SRT1720组中p-IRE1α/IRE1α的比值和cleaved Caspase3表达减少,Bcl2表达增加。TUNEL荧光染色结果表明同缺氧组小鼠相比,干扰组中凋亡细胞所占的比值明显增加,而激动组中凋亡细胞所占的比值明显减少。 研究结论: 1.紫绀组患者心肌中Sirt1表达水平高于非紫绀组。紫绀组患者心肌中自噬和凋亡水平高于非紫绀组。 2.在H9C2心肌细胞系中,上调Sirt1可显著增强缺氧心肌细胞自噬,Sirt1的促自噬作用与AMPK激活有关。 3.在H9C2心肌细胞系中,上调Sirt1可显著减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡。IRE1α为Sirt1调控的靶蛋白,上调Sirt1表达后,缺氧心肌细胞中IRE1α/JNK/c-jun和NF-κB p65通路的激活受到抑制。 4.在缺氧小鼠心肌中,药物激活Sirt1(SRT1720)能够增强自噬和缓解凋亡,而干扰Sirt1(EX-527)则会抑制自噬和加剧凋亡。
紫绀型先心病;发病机制;慢性缺氧条件;沉默信息调节因子1;细胞自噬;细胞凋亡
陆军军医大学
博士
外科学(胸心外科学)
肖颖彬
2019
中文
R541.102.32
2019-10-16(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)