PMC神经元集群活动的排尿控制作用及初步机制研究
机体通过排尿活动将代谢废物排出体外,从而达到维持正常生命活动和体液平衡的目的.膀胱正常的生理功能是存储尿液和排空尿液,其神经调控机制极其复杂,需要在大脑、脊髓及外周神经系统的共同精细调控下完成.上述任意层面的损伤或病变,均可能引起神经源性膀胱功能障碍(neurogenic bladder dysfunction,NGB).许多患有神经系统疾病的病人,如多发性硬化症、帕金森病、脊髓损伤和脊柱裂等,都伴有神经源性膀胱功能障碍.NGB常见的临床症状主要表现为尿频、尿急、尿失禁,有些患者甚至无法排尿以及伴有上尿路的感染.然而,现阶段对神经源性膀胱功能障碍的认识仍十分有限,其发病机理和病理生理过程亟待进一步研究.故深入解析调控膀胱的神经网络、探究生理性排尿行为的神经编码模式,将为神经源性膀胱功能障碍的诊断和治疗提供新的策略. 全面解析大脑与膀胱间的神经环路结构,是研究大脑调控膀胱功能及相关病理生理机制的基石.近年来神经解剖示踪技术发展迅速,一种名为伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)的疱疹病毒横空出世,该病毒可以逆行跨越多级突触结构,使解析外周脏器与大脑之间的神经传导通路成为可能.此外,探究调控膀胱或排尿活动相关脑区的神经编码模式,是解析大脑调控膀胱和排尿活动神经机制的最佳策略.随着基因编码钙离子指标剂(genetically encoded Ca2+indicators,GECIs)和基因靶向技术的发展,基于光纤的神经钙活动探测技术(又称为光纤光度法)成为了当下最流行的解析神经活动模式的研究技术.该方法可以在自由活动且清醒小鼠任意脑区进行神经元集群活动的监测.光纤光度法主要通过检测神经元集群的钙活动(钙信号),来反映这群神经元的平均簇状放电活动和动作电位发放水平.与传统的电生理技术相比,它具有易于上手、实验成本低和数据分析便捷等优势. 通过运用上述两项技术,本课题旨在解析中枢神经系统与膀胱之间的神经环路连接结构,并揭示脑桥排尿中枢(pontine micturition center,PMC)神经元集群在排尿活动和膀胱不同状态下的活动特征和机制.主要开展了以下实验: (1)为了明确参与支配膀胱逼尿肌的神经元在脊髓和外周神经的分布情况,雄性小鼠膀胱注射PRV-EGFP4.5-5天后,对其脊髓和膀胱组织进行切片和免疫组化处理,再使用共聚焦显微成像技术观测PRV-EGFP标记的细胞在切片中的分布;或者运用荧光显微切片断层成像(Fluorescence Micro-Optical Sectioning Tomography,fMOST)技术直接对小鼠脊髓组织进行连续切片和荧光图片采集. (2)为了明确参与支配膀胱逼尿肌的脑区分布,雄性小鼠膀胱注射PRV-EGFP4.5-5天后,对其脑组织进行切片和免疫组化处理,再使用共聚焦显微成像技术观测PRV-EGFP标记的细胞在切片中的分布,或者运用fMOST技术直接对脑组织进行连续切片和荧光图片采集.为了明确雌性和雄性小鼠参与支配膀胱逼尿肌的脑区分布是否有差别,分别对雌性和雄性小鼠的膀胱进行了PRV-EGFP注射.为了明确膀胱感染PRV不同时间点对PRV脑内标记的影响,分别获取了膀胱感染PRV-EGFP3天、4天和4.5至5天的小鼠脑组织.为了明确参与支配膀胱逼尿肌不同部位的脑区是否存在差异,分别将PRV-EGFP和PRV-RFP注射入膀胱左右侧壁内. (3)为了明确参与支配膀胱逼尿肌的大脑皮层区域的具体定位,运用fMOST技术对PRV-EGFP标记的皮层区域进行连续切片和数据采集,并观测PRV-EGFP标记的皮层区域的具体位置;或者使用共聚焦显微成像技术观测PRV-EGFP标记的皮层区域的具体位置. (4)为了明确参与支配膀胱逼尿肌的PMC区的精准坐标,将共聚焦采集到的PMC形态学结果与经典小鼠脑图谱进行对比.为了明确PMC的上游脑区,通过脑内病毒注射技术将腺相关病毒(AAV-Retro-hSyn-EYFP)注射入小鼠的PMC脑区内,病毒表达一个月后,对小鼠脑组织进行切片,并使用共聚焦显微成像技术观测PRV-EGFP标记的细胞在脑内的分布. (5)为了明确PMC神经元集群的活动是否与清醒自由运动小鼠的排尿活动相关联,运用基于光纤的神经钙活动记录技术来探测PMC神经元集群的活动,并同步记录小鼠的排尿行为. 主要研究结果: (1)PRV标记的神经元在小鼠脊髓和外周神经中的分布 PRV-EGFP标记膀胱内的神经纤维,这些神经纤维来自于外周神经节内的神经元.在脊髓中,发现在腰骶髓中间外侧柱区域(the intermediolateralarea,IML)、背侧灰质后连合(the dorsal gray commissure,DGC)和脊髓背角浅层(the superficial dorsal horn,SDH)均有PRV-EGFP标记的神经元;位于IML中的骶髓副交感神经元(the sacral parasympathetic preganglionic neurons,SPN)也感染了PRV-EGFP;在L1-L2中PRV-EGFP感染的神经元主要分布在这些脊髓层面的中间外侧柱区域(IML)和背侧灰质后连合(DGC),而颈段脊髓鲜有PRV-EGFP感染的神经元.(n=5只雄性小鼠) (2)PRV标记的神经元在小鼠大脑内的分布 PRV-EGFP标记的神经元主要分布在:脑桥排尿中枢(PMC)、网状核(gigantocellular reticular nucleus,Gi)、髓中缝核(Raphe nuclei)、蓝斑核(locus coeruleus,LC)、脑干A5细胞群组、中脑导水管灰质区(periaqueductal gray,PAG)、红核(Red nucleus)、下丘脑的内侧视前区(medial preoptic area,MPA)、下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN)、外侧下丘脑(lateral hypothalamic area,LH)和部分大脑皮层区域(n=5只雄性小鼠).在对照组(PRV-EGFP注射入下腹壁)中,上述脑区均未发现PRV标记的神经元(n=3只雄性小鼠).运用fMOST技术和三维重建法,率先绘制出了支配雄性小鼠膀胱逼尿肌相关脑内神经元的三维脑图谱. 同一只雄性小鼠的膀胱左右侧壁分别注射PRV-EGFP和PRV-RFP病毒后,两种PRV感染的主要脑区相同;雌鼠膀胱注射PRV后,PRV感染的脑区与雄鼠的结果相同(n=3只小鼠/组).PRV-EGFP注射3天后,大脑内仅在PMC和Gi区发现少量PRV-EGFP标记的神经元;PRV-EGFP注射4天后,上述主要脑区均出现PRV-EGFP标记的神经元(n=3只雄小鼠/组). (3)PRV标记的神经元在大脑皮层的分布 PRV-EGFP标记的小鼠大脑皮层区域为初级运动(primary motor cortex,M1)和感觉皮层(primary somatosensory cortex,S1),这些神经元主要位于它们的第五层,从形态学上判断它们都是椎体神经元;通过fMOST技术和三维重建,明确了整个PRV-EGFP标记的皮层区域的范围(前后跨度约为960μm)和PRV-EGFP标记的皮层神经元总数目(约为970个,n=3只雄性小鼠),PRV感染膀胱4天后皮层才出现PRV-EGFP标记的神经元(n=3只雄性小鼠).上述结果提示皮层是PMC的上游脑区. (4)PRV标记的神经元在PMC的精确定位和PMC上游脑区的分布 小鼠核心PMC区的坐标:AP为-5.45mm,ML为±0.7mm,DV为-3.15mm.PMC的上游脑区,主要包括PAG、M1、S1、PVN、LH和前额叶皮层在内的多个脑区,这些区域内的神经元可以直接投射至PMC(n=3只雄性小鼠). (5)PMC神经元集群的钙信号(神经活动)与清醒自由运动小鼠的排尿活动密切相关 小鼠自主排尿活动时,实验组(PMC神经元表达GCaMP6f)小鼠可以稳定地记录到与排尿活动高度相关的钙信号,而对照组(PMC神经元表达EGFP)小鼠则未记录到与排尿活动高度相关的钙信号.定量对比显示实验组小鼠排尿过程中PMC神经元集群荧光强度变化的幅值明显高于对照组(PMC神经元表达GCaMP6f组,maxΔf/f=36.73％±4.90%;PMC神经元表达EGFP组,maxΔf/f=2.24%±0.66%;P<0.001;n=7只小鼠/组).由于对照组小鼠未记录到明显的PMC神经元集群荧光强度变化,进一步证实了所记录到的小鼠排尿相关的钙活动,代表PMC神经元的激活反应,而不是小鼠运动引起的运动噪音或者是"伪信号". 总结上述实验结果,本研究主要的结论有:大脑、脊髓和外周围神经构成了支配膀胱逼尿肌的多层次神经网络结构;整个膀胱逼尿肌接受相同脑区的神经支配;支配膀胱逼尿肌的脑神经网络不存在性别差异;位于M1和S1区第五层的椎体神经元参与支配膀胱逼尿肌;PMC有多个上游脑区,如皮层、PAG和LH等;PMC神经元集群的活动与排尿活动和膀胱逼尿肌的收缩功能密切相关;PMC神经元集群的激活是启动正常排尿活动和膀胱逼尿肌收缩的最基本条件.
神经源性膀胱功能障碍;发病机制;脑桥排尿中枢;神经元集群;神经编码模式
陆军军医大学
博士
外科学(泌尿外)
李为兵
2019
中文
R694.502.32
2019-10-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）