MAP4磷酸化在病理性心脏重塑中的作用及机制研究
目的： 本课题组前期研究发现，严重烧伤后早期心肌即已发生缺血缺氧损害。细胞实验结果提示，微管相关蛋白4（microtubule associated protein4,MAP4）磷酸化增高是引起心肌细胞缺血缺氧损害的重要机制。但是在临床患者和在体动物中，MAP4持续磷酸化增高会对心脏产生何种病理生理影响尚不明确。因此，探究MAP4持续磷酸化的病理生理意义有助于进一步认识严重烧伤后心肌缺血缺氧损害的可能机制，并为临床防治心肌缺血缺氧损害提供重要靶点和方向。 作为调节细胞骨架动力学的重要分子，微管相关蛋白家族（microtubule associated proteins,MAPs）具有与微管（microtubule,MT）结合并促进其聚合的特性,当MAPs磷酸化增加时，其活性下降，导致微管解聚。常见的三种MAPs包含MAP4，MAP2和tau，这其中仅有MAP4广泛表达于非神经元细胞，而MAP2和tau多表达于神经元组织中。既往大量研究表明，位于人源性微管结合域内的脯氨酸富集区域的丝氨酸696、768和787位点磷酸化水平的改变，对于调节微管动力学有着重要意义，而且丝裂原活化蛋白激酶激酶6/p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase kinase6,MKK6）/（p38mitogen-activated protein kinase,p38/MAPK）是介导缺氧条件下MAP4磷酸化增高和微管解聚的重要上游激酶。除了微管动力学改变，本课题组前期的体外实验还证明了MAP4磷酸化对于心肌细胞线粒体途径凋亡具有重要作用：MAP4磷酸化后与微管蛋白结合力下降，从微管蛋白上脱落后转位到线粒体上，继而引起线粒体通透转换孔的开放和细胞色素c的释放，从而启动线粒体凋亡的发生。尽管如此，当MAP4持续磷酸化时，微管动力学和线粒体的变化会在在体动物中引起何种改变，以及产生的临床效应如何，均有待进一步探索。 因此，本研究通过观察缺氧和压力负荷心脏疾病动物模型心肌组织，以及法洛四联症患者心肌标本中MAP4磷酸化的改变，了解其在心脏疾病中的普遍意义；继而通过构建MAP4定点突变的基因敲入小鼠模拟MAP4持续磷酸化，探索其在在体动物上可能导致的病理生理效应及其具体机制，旨在深入揭示临床相关疾病发生机制，并为其治疗提供新的方向和靶点。 方法： 1.从新桥医院心外科收集16例经手术治疗的法洛四联症（tetralogy of fallot,TOF）患者的肥厚心脏右心室标本（约100mg），并根据患者动脉血氧饱和度（arterial oxygen saturation,SaO2）分为两组（SaO2＜90％和SaO2≥90%，各8例）；构建心肌梗塞（myocardial infarction,MI）和主动脉缩窄（transverse aortic constriction,TAC）小鼠动物模型，分别获得其左心室心肌标本；通过免疫印迹对所获得的三种心肌病理标本进行检测，了解MAP4（S696,S768,S787）（对应小鼠位点为S667,S737,S760）和p38/MAPK磷酸化水平在不同类型心脏疾病中的变化情况。 2.委托上海南方模式生物科技发展有限公司通过基因编辑技术（clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein9,CRISPR/Cas9）构建MAP4（S667A,S737E,S760E）基因敲入小鼠（MAP4KI），并利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术对小鼠进行鉴定。分别对10-14、30-34和70-74周龄的野生型（wild type,WT）和MAP4KI小鼠进行观察检测，通过超声心动图、无创血压、试剂盒、免疫印迹、免疫荧光、病理切片染色、透射电镜、大体检测、免疫组化等多种方法和手段了解MAP4磷酸化对心脏形态、功能和病理变化的影响。同时，通过构建模拟MAP4（S768A和S787A）去磷酸化突变体（MAP4（alanine,Ala（A）））转染WT和MAP4KI原代小鼠乳鼠心肌细胞或成纤维细胞，干预异丙肾上腺素（isoprenaline,ISO）（20μM）介导的体外病理性心脏重塑模型，进一步明确MAP4磷酸化在病理性心脏重塑中的作用。 3.通过收集10-14和70-74周龄的WT和MAP4KI小鼠的左心室心脏组织，利用原位末端凋亡法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL）试剂盒、病理切片染色、免疫印迹和透射电镜观察心肌细胞凋亡、坏死和坏死性凋亡、线粒体凋亡关键酶和线粒体超微结构损伤情况，通过分离提取小鼠心脏组织线粒体和非线粒体样本，利用免疫印迹法检测线粒体细胞色素c的释放情况；然后利用病理切染色、透射电镜和TUNEL组化染色法对TOF患者的右心室心脏标本进行检测，明确TOF患者心脏标本中心肌细胞凋亡和线粒体损伤情况；此外，利用MAP4（Ala）转染原代小鼠乳鼠心肌细胞，以ISO刺激48小时，通过免疫荧光共染、免疫印迹和透射电镜对心肌细胞凋亡、线粒体凋亡关键酶和线粒体超微结构进行检测，同时分离提取原代小鼠乳鼠心肌细胞线粒体和非线粒体成份，利用免疫印迹法检测原代心肌细胞线粒体细胞色素c的释放情况，以此明确MAP4磷酸化对心肌细胞凋亡的影响。 结果： 1.通过免疫印迹检测发现，SaO2＜90%较SaO2≥90%的TOF心脏标本提示，MAP4（S768和S787）磷酸化在缺氧组明显增加，而MAP4（S696）磷酸化和MAP4表达无显著差异；在MI小鼠模型中，血管结扎60、180和360min后，MAP4（S667,S737,S760）磷酸化均较假手术组明显增高，而结扎5min后未见明显差异，同时p38/MAPK的激活和MAP4磷酸化的变化趋势一致；而对于TAC小鼠模型，手术后3周获得左心室心脏标本，检测发现MAP4（S737和S760）磷酸化较假手术组明显增高，而MAP4（S667）磷酸化和MAP4表达较假手术组无显著差异，不仅如此，p38/MAPK在TAC手术后3周也较假手术组明显激活。 2.首先成功构建并鉴定MAP4KI小鼠，以同窝小鼠进行实验。通过免疫印迹检测发现，WT与MAP4KI在正常状态下，MAP4（S667）磷酸化水平无明显差异，且表达量均很低，而MAP4KI小鼠较WT小鼠的心脏MAP4（S737和S760）显著增高，提示模型构建成功。然后对10-14、30-34和70-74周龄的WT和MAP4KI小鼠进行心脏肥大指标的观察检测,发现MAP4KI小鼠在30-34周和70-74周时，心脏重量（heart weight,HW）、心脏重量/体重（heart weight/body weight,HW/BW）和心脏重量/胫骨长度（heart weight/tibia length,HW/TL）分别较对照组小鼠增加22%、19%和23%，心脏大体可见左心室游离壁和室间隔明显增厚；在体心功能提示，MAP4KI小鼠较WT小鼠表现为年龄依赖性的心脏舒缩功能减退，且舒张功能异常早于收缩功能异常；而且心肌细胞横截面面积、心脏肥大标志物心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide,ANP）和肌球蛋白重链7（myosin heavy chain7,MYH7）也明显增高，肌小节超微结构可见肌丝溶解和稀疏，呈现年龄依赖性的破坏加重，而在10-14周时，WT与MAP4KI小鼠在上述指标方面无显著差异。 3.获得10-14和70-74周龄的WT和MAP4KI小鼠的心脏组织标本并进行检测，结果发现，在10-14周龄时，MAP4KI小鼠心脏中活化的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（cleaved caspase-3）、线粒体细胞色素c的释放、线粒体超微结构损伤和心肌细胞凋亡均较WT组明显增加，而到70-74周时，这些破坏效应更加明显；而心肌组织坏死和坏死性凋亡的蛋白标志物在各个年龄段均无显著改变；而在TOF心脏标本中，观察到，缺氧组较常氧组心肌组织凋亡比例显著增加；同样地，通过体外培养WT和MAP4KI小鼠乳鼠原代心肌细胞，并以ISO进行刺激，发现转染MAP4（Ala）能够有效抑制ISO导致的心肌细胞凋亡和线粒体破坏增加，表现为cleaved caspase-3表达降低、细胞色素c释放减少，以及TUNEL标记的心肌凋亡阳性细胞减少和线粒体超微结构破坏减轻。 结论： 不论在缺氧和压力负荷心脏疾病动物模型，还是法洛四联症患者，心肌组织中MAP4磷酸化水平都较对照组显著增加。MAP4持续磷酸化导致病理性心脏重塑的发生发展，主要表现为心肌肥厚、纤维化、舒张和收缩功能下降。微管解聚、磷酸化MAP4线粒体转位以及心肌细胞凋亡增加可能是介导MAP4磷酸化引起病理性心脏重塑的重要机制，p38/MAPK则是介导MAP4磷酸化的重要上游激酶。以上结果有助于进一步深入认识心肌细胞通过何种途径感受缺血缺氧损害信号的这一科学问题，丰富了心脏缺血缺氧损害和心脏重塑发病机制的研究内容，为相关疾病的干预和治疗提供新靶点和方向。
心肌缺血缺氧损害;发病机制;微管相关蛋白4;磷酸化水平;心脏重塑
陆军军医大学
博士
外科学(烧伤)
黄跃生
2019
中文
R542.202.32
2019-10-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）