Klotho通过自噬介导的Cx43降解抑制血管钙化的研究
目的: 血管钙化(Vascular calcification,VC)是一个与骨发育相似的主动的、高度可调的复杂病理生理过程,是冠状动脉粥样硬化、高血压、糖尿病血管病变、血管损伤和慢性肾病等疾病中普遍存在的病理表现,同时也是心血管疾病发病率和死亡率增加的重要危险因素之一。因此,积极开展改善VC的相关研究具有重大科学意义和社会价值。 Klotho(KL)基因于1997年被发现,作为一种抗衰老基因被广泛研究。Klotho基因敲除鼠表现出一系列与人类早衰综合征患者相似的表型,其中就包括VC。体内实验证实,使用基因整合技术或外源性补充重组蛋白的方式恢复Klotho敲基因鼠中Klotho的表达可显著改善VC。而体外研究也发现,Klotho重组蛋白可显著减轻高磷诱导的小鼠主动脉平滑肌(Mouse aorta vascular smooth muscle,MOVAS)细胞的成骨样分化(血管钙化的重要起始环节)。Klotho的抗钙化的作用机制可归结于两方面。首先体内KL的正常表达可以维持细胞外液的钙磷平衡,其次Klotho还可以直接抑制细胞中的insulin/IGF-1信号通路和Wnt信号通路,而这些因素都是VC的重要致病因素。但是否还有其它机制参与,仍有待探究。 缝隙连接(Gap junction,GJ)是细胞间直接通讯的重要组成部分。其由缝隙连接蛋白(Conexin,Cx)所构成,作用是介导相邻细胞间能量和物质交换。在Cx家族中,Cx43是血管中表达最多的缝隙连接蛋白,且有报道指出,GJ介导的细胞间通讯对血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscles cells,VSMCs)的成骨样分化有直接影响。所以,Cx43可通过介导VSMCs的成骨样分化参与VC的发生。自噬是一种受刺激时,细胞内蛋白质和细胞器被降解的高度保守的病理生理过程,与许多疾病的发生发展密切相关。有研究证实,自噬起钙化抑制作用,且自噬可以降解Cx43。但在血管钙化模型中,Klotho与自噬的关系仍未可知。 因此,本研究拟从体内实验入手,探究Klotho敲基因鼠中自噬和钙化的改变,然后调控自噬,明确自噬的作用。然后在体外实验中,验证Klotho是否可以通过促进自噬抑制血管钙化以及进一步明确自噬的作用;最后,结合体内外实验,探究Klotho是否可以通过促进自噬介导的Cx43降解抑制血管钙化。 方法: 2.1 Klotho敲基因鼠基因型鉴定和VC检测 将Klotho杂合型(HZ)鼠合笼并繁殖后得到幼鼠,对幼鼠进行基因型鉴定后得到Klotho野生型(WT)和KL纯合型(KO)鼠。5周龄雄鼠可用于实验。 取出Klotho敲基因鼠的主动脉,分别通过von kossa染色法检测VC情况,邻甲酚酞络合酮(OCPC)法检测小鼠主动脉中的钙含量,免疫组化法检测小鼠血管中Runx2的表达,qPCR实验检测钙化相关分子Pit1、Pit2、Runx2和SM22mRNA的表达,western blot法检测Runx2和α-SMA蛋白的表达。 2.2 自噬在Klotho基因缺失导致血管钙化中的作用 2.2.1 检测Klotho基因敲除后,自噬的改变 取出Klotho敲基因鼠的主动脉,提取总蛋白,western blot实验检测LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62蛋白的表达。血管行冰冻切片后,免疫荧光法观察并统计组间小鼠血管中LC3点数和P62荧光的差异。 2.2.2 调控自噬后,观察血管钙化的变化 分别给予WT、KO鼠腹腔内注射适量的雷帕霉素(RA)和氯喹(CQ),2周后处死小鼠,取出主动脉,western blot实验检测LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62、Runx2和α-SMA蛋白的表达,,OCPC法检测小鼠主动脉的钙含量。 2.3 小鼠主动脉平滑肌(MOVAS)细胞鉴定 细胞免疫荧光实验观察Alexa-488标记的α-SMA在细胞中的表达。 2.4 MOVAS细胞的钙化诱导及鉴定 将MOVAS细胞消化接种到6孔板中,实验组使用钙化培养液(Calcificaiton medium,CM)处理8-12天,对照组用普通培养液处理,每2天换液1次;分别使用茜素红S染色观察钙沉积情况,OCPC法检测MOVAS细胞中的钙含量。 2.5 Klotho重组蛋白对自噬及VC的作用 2.5.1 Klotho重组蛋白对自噬的作用 使用Klotho重组蛋白伴/不伴有氯喹(自噬抑制剂)处理MOVAS细胞,western blot实验检测LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62蛋白的表达,双荧光LC3腺病毒转染MOVAS细胞后通过检测组间红点和黄点的差异来反映自噬流的改变。 2.5.2 Klotho重组蛋白对血管钙化的作用 使用Klotho重组蛋白伴/不伴有氯喹(自噬抑制剂)处理MOVAS细胞,western blot实验检测Runx2和α-SMA蛋白的表达,茜素红S染色实验观察钙沉积情况,OCPC法检测MOVAS细胞中的钙含量。 结果: 3.1 Klotho敲基因鼠表型及鉴定 从形态学来看,KO鼠形态明显小于WT和HZ鼠,有驼背,皮肤光泽度不佳。提取鼠尾DNA,PCR实验后跑电泳并显影。WT鼠只有野生型等位基因(458bp),KO鼠只有突变型等位基因(920bp),HZ鼠有两种等位基因都有。 3.2 Klotho敲基因鼠主动脉出现明显血管钙化 Von kossa实验结果显示:与WT鼠相比,HZ鼠主动脉开始出现钙化区域,KO鼠主动脉能观察到更多、更明显的钙化区域。 OCPC法检测主动脉钙含量,结果显示:HZ组和KO组血管钙含量均明显高于WT组(p<0.05,n=6),同时KO组血管钙含量高于HZ组(p<0.05,n=6)。 免疫组化实验检测主动脉Runx2表达,结果显示:Klotho基因被敲除后,Runx2的相对表达量逐渐增加(WT vs.HZ vs.KO;p<0.05;n=6)。 qPCR实验检测主动脉钙化相关因子mRNA的表达,结果显示:Klotho基因敲除后Pit1、Pit2及Runx2mRNA的相对表达量均增加(WT vs.HZ vs.KO;p<0.05,n=6),而SM22mRNA的相对表达量降低(WT vs.HZ vs.KO;p<0.05,n=6)。 3.3 Klotho基因被敲除后自噬上调 Western blot实验检测Klotho敲除后小鼠主动脉自噬的改变,结果显示:随着Klotho基因的敲除,LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量增加(WT vs.HZ vs.KO;p<0.05,n=6),而P62蛋白的相对表达量降低(WT vs.HZ vs.KO;p<0.05,n=6)。 3.4 在Klotho敲基因鼠体内调控自噬,检测钙化的改变 Western blot实验检测使用雷帕霉素促进自噬后钙化的改变,结果显示:使用雷帕霉素促进自噬,LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量增加(KO vs.KO+RA;p<0.05,n=6)而P62蛋白的相对表达量降低(KO vs.KO+RA;p<0.05,n=6),钙化相关转录因子Runx2蛋白的相对表达量降低(KO vs.KO+RA;p<0.05,n=6),而骨架蛋白α-SMA的相对表达量增加(KOvs.KO+RA;p<0.05,n=6)。 通过OCPC法检测主动脉钙含量,结果显示:KO鼠腹腔注射雷帕霉素促进自噬后,主动脉钙含量下降(KO vs.KO+RA;p<0.05,n=6),而给予氯喹抑制自噬后,主动脉钙含量增加(KO vs.KO+RA;p<0.05,n=6)。 3.5 体外实验中用Klotho重组蛋白处理细胞后,检测钙化及自噬 首先通过细胞免疫荧光实验鉴定所得细胞为MOVAS细胞株,并通过茜素红S染色及钙含量测定实验证明细胞钙诱导成功。 Western blot实验检测给予Klotho重组蛋白处理后自噬的改变,结果显示:钙化诱导后,LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量增加(WT vs.CM;p<0.05,n=3),但P62蛋白的相对量降低(WT vs.CM;p<0.05,n=3)。在钙化诱导的基础上,使用Klotho重组蛋白处理细胞,发现LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量继续增加(CM vs.CM+KL;p<0.05,n=3),而P62蛋白的相对量继续降低(CM vs.CM+KL;p<0.05,n=3)。在Klotho重组蛋白基础上再使用氯喹抑制自噬,则LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量进一步增加(CM+KL vs.CM+KL+CQ;p<0.05,n=3),而P62蛋白的相对量升高(CM+KL vs.WT+KL+CQ;p<0.05,n=3)。 结论: 4.1 5周龄Klotho敲基因鼠主动脉出现明显血管钙化。 4.2 Klotho敲基因鼠主动脉自噬上调,且这种上调是一种保护性改变。 4.3 Klotho可通过促进自噬抑制血管钙化。 4.4 Klotho可通过促进自噬介导的Cx43降解抑制血管钙化。
血管钙化;发病机制;Klotho基因;细胞自噬;缝隙连接蛋白43
陆军军医大学
博士
内科学(心血管病)
赵晓辉
2019
中文
R543.023.2
2019-10-16(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)