Klotho通过自噬介导的Cx43降解抑制血管钙化的研究
目的： 血管钙化（Vascular calcification，VC）是一个与骨发育相似的主动的、高度可调的复杂病理生理过程，是冠状动脉粥样硬化、高血压、糖尿病血管病变、血管损伤和慢性肾病等疾病中普遍存在的病理表现，同时也是心血管疾病发病率和死亡率增加的重要危险因素之一。因此，积极开展改善VC的相关研究具有重大科学意义和社会价值。 Klotho（KL）基因于1997年被发现，作为一种抗衰老基因被广泛研究。Klotho基因敲除鼠表现出一系列与人类早衰综合征患者相似的表型，其中就包括VC。体内实验证实，使用基因整合技术或外源性补充重组蛋白的方式恢复Klotho敲基因鼠中Klotho的表达可显著改善VC。而体外研究也发现，Klotho重组蛋白可显著减轻高磷诱导的小鼠主动脉平滑肌（Mouse aorta vascular smooth muscle，MOVAS）细胞的成骨样分化（血管钙化的重要起始环节）。Klotho的抗钙化的作用机制可归结于两方面。首先体内KL的正常表达可以维持细胞外液的钙磷平衡，其次Klotho还可以直接抑制细胞中的insulin/IGF-1信号通路和Wnt信号通路，而这些因素都是VC的重要致病因素。但是否还有其它机制参与,仍有待探究。 缝隙连接（Gap junction，GJ）是细胞间直接通讯的重要组成部分。其由缝隙连接蛋白（Conexin，Cx）所构成，作用是介导相邻细胞间能量和物质交换。在Cx家族中，Cx43是血管中表达最多的缝隙连接蛋白，且有报道指出，GJ介导的细胞间通讯对血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscles cells，VSMCs）的成骨样分化有直接影响。所以，Cx43可通过介导VSMCs的成骨样分化参与VC的发生。自噬是一种受刺激时，细胞内蛋白质和细胞器被降解的高度保守的病理生理过程，与许多疾病的发生发展密切相关。有研究证实，自噬起钙化抑制作用，且自噬可以降解Cx43。但在血管钙化模型中，Klotho与自噬的关系仍未可知。 因此，本研究拟从体内实验入手，探究Klotho敲基因鼠中自噬和钙化的改变，然后调控自噬，明确自噬的作用。然后在体外实验中，验证Klotho是否可以通过促进自噬抑制血管钙化以及进一步明确自噬的作用；最后，结合体内外实验，探究Klotho是否可以通过促进自噬介导的Cx43降解抑制血管钙化。 方法： 2.1 Klotho敲基因鼠基因型鉴定和VC检测 将Klotho杂合型（HZ）鼠合笼并繁殖后得到幼鼠，对幼鼠进行基因型鉴定后得到Klotho野生型（WT）和KL纯合型（KO）鼠。5周龄雄鼠可用于实验。 取出Klotho敲基因鼠的主动脉，分别通过von kossa染色法检测VC情况，邻甲酚酞络合酮（OCPC）法检测小鼠主动脉中的钙含量，免疫组化法检测小鼠血管中Runx2的表达，qPCR实验检测钙化相关分子Pit1、Pit2、Runx2和SM22mRNA的表达，western blot法检测Runx2和α-SMA蛋白的表达。 2.2 自噬在Klotho基因缺失导致血管钙化中的作用 2.2.1 检测Klotho基因敲除后，自噬的改变 取出Klotho敲基因鼠的主动脉，提取总蛋白，western blot实验检测LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62蛋白的表达。血管行冰冻切片后，免疫荧光法观察并统计组间小鼠血管中LC3点数和P62荧光的差异。 2.2.2 调控自噬后，观察血管钙化的变化 分别给予WT、KO鼠腹腔内注射适量的雷帕霉素（RA）和氯喹（CQ），2周后处死小鼠，取出主动脉，western blot实验检测LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62、Runx2和α-SMA蛋白的表达，，OCPC法检测小鼠主动脉的钙含量。 2.3 小鼠主动脉平滑肌（MOVAS）细胞鉴定 细胞免疫荧光实验观察Alexa-488标记的α-SMA在细胞中的表达。 2.4 MOVAS细胞的钙化诱导及鉴定 将MOVAS细胞消化接种到6孔板中，实验组使用钙化培养液（Calcificaiton medium，CM）处理8-12天，对照组用普通培养液处理，每2天换液1次；分别使用茜素红S染色观察钙沉积情况，OCPC法检测MOVAS细胞中的钙含量。 2.5 Klotho重组蛋白对自噬及VC的作用 2.5.1 Klotho重组蛋白对自噬的作用 使用Klotho重组蛋白伴/不伴有氯喹（自噬抑制剂）处理MOVAS细胞，western blot实验检测LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62蛋白的表达，双荧光LC3腺病毒转染MOVAS细胞后通过检测组间红点和黄点的差异来反映自噬流的改变。 2.5.2 Klotho重组蛋白对血管钙化的作用 使用Klotho重组蛋白伴/不伴有氯喹（自噬抑制剂）处理MOVAS细胞，western blot实验检测Runx2和α-SMA蛋白的表达，茜素红S染色实验观察钙沉积情况，OCPC法检测MOVAS细胞中的钙含量。 结果： 3.1 Klotho敲基因鼠表型及鉴定 从形态学来看，KO鼠形态明显小于WT和HZ鼠，有驼背，皮肤光泽度不佳。提取鼠尾DNA，PCR实验后跑电泳并显影。WT鼠只有野生型等位基因（458bp），KO鼠只有突变型等位基因（920bp），HZ鼠有两种等位基因都有。 3.2 Klotho敲基因鼠主动脉出现明显血管钙化 Von kossa实验结果显示：与WT鼠相比，HZ鼠主动脉开始出现钙化区域，KO鼠主动脉能观察到更多、更明显的钙化区域。 OCPC法检测主动脉钙含量，结果显示：HZ组和KO组血管钙含量均明显高于WT组（p＜0.05,n=6），同时KO组血管钙含量高于HZ组（p＜0.05,n=6）。 免疫组化实验检测主动脉Runx2表达，结果显示：Klotho基因被敲除后，Runx2的相对表达量逐渐增加（WT vs.HZ vs.KO;p＜0.05;n=6）。 qPCR实验检测主动脉钙化相关因子mRNA的表达，结果显示：Klotho基因敲除后Pit1、Pit2及Runx2mRNA的相对表达量均增加（WT vs.HZ vs.KO;p＜0.05,n=6），而SM22mRNA的相对表达量降低（WT vs.HZ vs.KO;p＜0.05,n=6）。 3.3 Klotho基因被敲除后自噬上调 Western blot实验检测Klotho敲除后小鼠主动脉自噬的改变，结果显示：随着Klotho基因的敲除，LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量增加（WT vs.HZ vs.KO;p＜0.05,n=6），而P62蛋白的相对表达量降低（WT vs.HZ vs.KO；p＜0.05，n=6）。 3.4 在Klotho敲基因鼠体内调控自噬，检测钙化的改变 Western blot实验检测使用雷帕霉素促进自噬后钙化的改变，结果显示：使用雷帕霉素促进自噬，LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量增加（KO vs.KO+RA;p＜0.05,n=6）而P62蛋白的相对表达量降低（KO vs.KO+RA;p＜0.05,n=6），钙化相关转录因子Runx2蛋白的相对表达量降低（KO vs.KO+RA;p＜0.05,n=6），而骨架蛋白α-SMA的相对表达量增加（KOvs.KO+RA;p＜0.05,n=6）。 通过OCPC法检测主动脉钙含量，结果显示：KO鼠腹腔注射雷帕霉素促进自噬后，主动脉钙含量下降（KO vs.KO+RA;p＜0.05,n=6），而给予氯喹抑制自噬后，主动脉钙含量增加（KO vs.KO+RA;p＜0.05,n=6）。 3.5 体外实验中用Klotho重组蛋白处理细胞后，检测钙化及自噬 首先通过细胞免疫荧光实验鉴定所得细胞为MOVAS细胞株，并通过茜素红S染色及钙含量测定实验证明细胞钙诱导成功。 Western blot实验检测给予Klotho重组蛋白处理后自噬的改变，结果显示：钙化诱导后，LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量增加（WT vs.CM;p＜0.05,n=3），但P62蛋白的相对量降低（WT vs.CM;p＜0.05,n=3）。在钙化诱导的基础上，使用Klotho重组蛋白处理细胞，发现LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量继续增加（CM vs.CM+KL;p＜0.05,n=3），而P62蛋白的相对量继续降低（CM vs.CM+KL;p＜0.05,n=3）。在Klotho重组蛋白基础上再使用氯喹抑制自噬，则LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量进一步增加（CM+KL vs.CM+KL+CQ;p＜0.05,n=3），而P62蛋白的相对量升高（CM+KL vs.WT+KL+CQ;p＜0.05,n=3）。 结论： 4.1 5周龄Klotho敲基因鼠主动脉出现明显血管钙化。 4.2 Klotho敲基因鼠主动脉自噬上调，且这种上调是一种保护性改变。 4.3 Klotho可通过促进自噬抑制血管钙化。 4.4 Klotho可通过促进自噬介导的Cx43降解抑制血管钙化。
血管钙化;发病机制;Klotho基因;细胞自噬;缝隙连接蛋白43
陆军军医大学
博士
内科学(心血管病)
赵晓辉
2019
中文
R543.023.2
2019-10-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）