利用SUMO融合技术在大肠杆菌中表达抗菌肽BSN-37
近年来,随着传统抗生素的不合理使用,致使残留问题日益严重,耐药菌株不断出现.因此,寻找抗生素替代物迫在眉睫.抗菌肽是生物体在抵抗外来微生物入侵时产生的一类防御性小肽,因其独特的优势有望成为抗生素的替代物.由于天然抗菌肽来源有限,从生物体内提取步骤繁琐,获得产量不高;化学合成法虽然可大量获得抗菌肽,但其合成成本相对较高;因此,通过基因工程实现抗菌肽的体外表达是今后的研究重点和发展方向. 抗菌肽BSN-37是本实验室具有自主知识产权的牛源抗菌肽,该抗菌肽是由37个氨基酸组成(序列为:FRPPIRRPPIRPPFYPPFRPPIRPPIFPPIRPPFRPP),分子量为3.3kDa,前期的研究结果发现该抗菌肽具有较好的抗菌活性.为了获得高效的抗菌肽BSN-37,同时克服抗菌肽BSN-37对宿主细菌的破坏作用,本试验采用融合表达的方式,在大肠杆菌中表达具有较好抑菌活性的抗菌肽BSN-37. 根据抗菌肽BSN-37的氨基酸序列和大肠杆菌偏爱密码子,反向翻译出其基因片段,合成BSN-37基因,大小为126bp,并将其克隆至PUC57载体中,命名为PUC-BSN-37.将原核表达载体pGEX-6p-1和目的基因PUC-BSN-37经BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切后,通过T4DNA连接酶进行连接并转化大肠杆菌DH5α,构建pGEX-6p-1-BSN-37重组质粒,对重组质粒进行PCR、双酶切以及测序鉴定;将构建好的阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经SDS-PAGE和Western Blot检测显示:空载体工程菌在26kDa处有明显的标签蛋白GST的表达,而含有BSN-37的融合蛋白在30kDa处表达不明显或表达量很低. 为了提高抗菌肽BSN-37表达产量,本研究选择了SUMO分子伴侣在大肠杆菌中表达抗菌肽,以PUC-BSN-37为模板,分别设计含有XhoⅠ和HindⅢ双酶切位点的上下游引物,扩增出目的基因BSN-37;将融合型表达载体pCold-SUMO与目的基因BSN-37经XhoⅠ和HindⅢ分别双酶切后,通过T4DNA连接酶进行连接并转化大肠杆菌DH5α,构建pCold-SUMO-BSN-37重组质粒,并对重组质粒进行菌液PCR、双酶切以及测序鉴定. 将构建好的阳性质粒pCold-SUMO-BSN-37转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经过对表达条件的优化,摸索出表达的最佳条件.结果显示:终浓度为0.4μM的IPTG在37℃、pH7.2的条件下诱导6h,表达效果最好.经SDS-PAGE电泳检测,表达产物是以可溶性形式存在. 由于BSN-37的N-端加了His标签,因而利用亲和层析的方法进行目的蛋白的纯化,并通过SDS-PAGE和Western Blot对其表达量进行检测;将纯化后的目的蛋白用SUMO蛋白酶在4℃酶切12h获得融合蛋白,经过浓缩除盐后再次进行纯化,获得目的蛋白;通过双层琼脂扩散试验对目的蛋白进行活性检测.结果显示:上清液中检测到的目的蛋白约为25kDa,而标签蛋白大小约为19kDa,与预期结果相符;酶切后的目的蛋白对沙门氏菌CVCC541具有良好的抑菌活性. 综上所述,本研究利用融合技术将抗菌肽BSN-37在大肠杆菌中获得可溶性表达,检测到了相应的抗菌活性,为进一步研究牛源抗菌肽的表达以及开发新型抗菌药物奠定基础.
抗菌肽;基因工程;融合技术;抑菌活性
河南科技学院
硕士
预防兽医学
胡建和
2019
中文
TQ464.7
2019-09-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）