猝死肉鸡心脏损伤与心肌细胞线粒体损伤的相关性研究
肉鸡猝死综合征（Sudden Death Syndrome，SDS），是引起商品肉鸡死亡的重要疾病之一，大多数肉鸡品系对本病易感，且一年四季都可发生，因此对肉鸡生产造成了严重的经济损失。SDS的病因很复杂，与众多因素有关，确切的病因和发病机制尚不明确，但目前普遍认为SDS是一种与肉鸡心功能异常有关的代谢病。在SDS中，心脏呈现肌无力和收缩异常，且ATP生成减少。此现象提示：线粒体动力学可能在SDS中发挥作用。线粒体是一种高度动态变化的细胞器，有细胞内“能量工厂”之称。线粒体通过不断地融合-分裂维持其正常功能。心肌细胞中90％以上能量是由线粒体氧化磷酸化所提供，为了深入细致地研究肉鸡猝死综合征的发病机理，故进行了本研究。 本试验以眼观生长状态良好且突然死亡的肉鸡为研究对象（35日龄左右），迅速摘取心脏，分离左心室：采用液氮冻存、甲醛固定和戊二醛固定保存病料。通过（1）心肌组织固定、制备石蜡切片进行HE染色，观察心肌细胞病理组织学变化；（2）利用透射电镜观察猝死肉鸡心肌细胞及线粒体的超微结构；（3）Western blot方法检测Drp1和COXⅣ蛋白在肉鸡心肌细胞中的的表达差异和Drp1向心肌细胞粒体的转位情况；（4）real-time PCR方法检测肾上腺素受体β1、β2、β3基因的mRNA转录水平，初步研究猝死肉鸡的心脏损伤情况及心肌细胞损伤的分子病理机制。为了进一步探讨线粒体在肉鸡猝死过程中发挥的作用，本研究又采用培养鸡胚原代心肌细胞，建立肉鸡猝死心肌细胞损伤模型，从细胞水平开展试验研究，重点研究线粒体动力学在SDS肉鸡心肌细胞变性损伤过程中的作用及其机制。建立肉鸡猝死心肌细胞模型：（1）采用10mM、20mM、40mM三个不同浓度的乳酸对心肌细胞进行暴露处理，观察乳酸暴露时原代心肌细胞的形态变化和进行细胞活力检测（CCK8）；（2）利用凋亡检测试剂盒和线粒体膜电位检测试剂盒，检测体外模型中心肌细胞的凋亡情况和线粒体膜电位的变化。 本研究的结果如下：（1）HE病理组织学结果显示：与对照组相比，猝死肉鸡心肌细胞有严重颗粒变性和一定程度的局灶性坏死，心肌细胞间质增宽并有脂肪浸润。（2）透射电镜结果显示：正常心脏左心室心肌组织中肌原纤维排列整齐、肌节完整，线粒体结构完整，且线粒体嵴密集；猝死肉鸡心肌细胞明显肿胀，肌原纤维排列紊乱、稀疏，多数肌节消失；部分肌原纤维断裂、溶解，形成空白溶解灶；线粒体嵴断裂或溶解消失，部分线粒体呈空泡状。（3）Western blot检测结果显示：猝死肉鸡心肌细胞中Drp1的蛋白表达量升高且发生线粒体转位的Drp1数量升高，表明猝死肉鸡心肌细胞中发生了线粒体动力学异常；real-time PCR结果显示：对照组中肾上腺素受体β1、β2表达量接近（差异不显著），而猝死组中肾上腺素受体β1、β2表达量显著降低且β3表达量显著降升高，表明在肉鸡猝死中心衰过程发生迅速，且肉鸡死于心衰晚期。（4）本实验分离培养鸡胚原代心肌细胞（CECs），光镜下可见分离的细胞具有典型心肌细胞的形态、跳动信息，为了鉴定分离细胞的纯度，利用间接免疫荧光法对α-actin进行染色。结果显示：心肌细胞阳性率大于95%，表明原代心肌细胞培养成功。（5）对CECs进行乳酸暴露建立猝死肉鸡心肌细胞损伤模型，暴露组细胞可见心肌细胞折光性变低，细胞收缩次数明显减少，有死细胞出现等形态学变化，且经CCK8检测后发现细胞活力明显下降，表明猝死肉鸡心肌细胞损伤模型建立成功。（6）对乳酸暴露的CECs进行Annexin V-PE/7-AAD染色，流式细胞术检测后发现，乳酸暴露致心肌细胞发生凋亡，且CECs的线粒体发生明显损伤，表现在线粒体膜电位下降（JC-1染色）。
肉鸡猝死综合征;发病机理;心肌细胞;线粒体损伤;细胞凋亡
河南科技学院
硕士
临床兽医学
葛亚明;胡东方
2019
中文
S858.31;S856.5
2019-09-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）