三色堇热激蛋白70(VtHSP70)基因克隆及热胁迫下应答分析
三色堇为堇菜科堇菜属多年生草本观赏花卉，但多数三色堇品种不耐高温，严重制约了三色堇的应用，所以研究三色堇的抗热机制对于三色堇的应用及耐热新品种选育具有重要意义。本研究基于三色堇热激转录组数据库，筛选了16个高温条件下表达显著差异的VtHSP70基因。本研究以耐热三色堇材料DFM-16和热敏材料08H为研究对象，研究内容如下： （1）对16个VtHSP70基因的DNA片段进行PCR验证，获得14个与转录组结果吻合的基因。采用real-time PCR技术分析了DFM-16和08H两个材料中14个VtHSP70基因在室温条件下和42℃热激1h、2h、6h、12h的表达水平。结果显示：随着热胁迫时间增长，8个基因（VtHSP70-2、VtHSP70-4、VtHSP70-5、VtHSP70-8、VtHSP70-11、VtHSP70-14、VtHSP70-15、VtHSP70-16）的表达水平在耐热三色堇材料DFM-16中一直高于热敏材料08H，其中，VtHSP70-16基因在08H材料中不受高温诱导，但在DFM-16材料中热胁迫下表达水平显著增高；4个基因（VtHSP70-3、VtHSP70-6、VtHSP70-9、VtHSP70-13）在08H材料中短暂地高于DFM-16材料。从热胁迫后基因诱导表达的程度来看，VtHSP70-6基因在两份材料中热激处理2h时的表达量达到最高，但DFM-16中达到对照的6554.2倍，08H材料达到对照的4513.0倍，VtHSP70-15基因在08H材料中热激处理1h时的表达量仅为对照的0.36倍，DFM-16材料中为对照的17.75倍，表明VtHSP70基因的表达水平与三色堇的耐热性呈正相关。 （2）通过RACE技术对14个VtHSP70基因进行了全长序列克隆，最终获得了3个基因的全长，分别为VtHSP70-4，VtHSP70-8和VtHSP70-16。其中DFM-16和08H中的VtHSP70-8基因全长，序列长度分别为2275bp和2346bp；08H材料中VtHSP70-4基因全长，序列长度为1749bp；以及DFM-16和08H材料中的VtHSP70-16基因全长，序列长度均为2042bp。生物信息学分析结果显示：3个基因预测编码的蛋白均为亲水性蛋白；3个基因推测的氨基酸序列比对相似性为74.24%，表明VtHSP70基因高度保守。 （3）对VtHSP70-16基因的cDNA和gDNA进行PCR扩增，序列分析显示，两种材料中的VtHSP70-16cDNA序列长度和开放阅读框长度相同，编码649个氨基酸，氨基酸序列相似性为98.61%。推测的氨基酸序列均含有一段胞质HSP70的特征序列EEVD，系统进化树分析结果也证明VtHSP70-16定位于细胞质中。此外，两个材料中的VtHSP70-16gDNA结构也相似，都包含一个内含子，但内含子序列有9bp碱基差异。 （4）采用基因组步移法克隆了两个材料中VtHSP70-16基因的启动子序列，序列分析显示，两种材料中的VtHSP70启动子序列差异较大，相似性为34.20%，元件预测分析表明DFM-16材料中的增强元件比08H材料多21个，说明VtHSP70基因启动子在三色堇耐热性中起重要作用。
三色堇;耐热品种选育;热激蛋白70;基因克隆;转录组学
河南科技学院
硕士
观赏园艺学
刘会超
2019
中文
S682;S603.4
2019-09-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）