miR-145靶向PXN调控奶牛乳腺炎发病分子机制初探
奶牛乳腺炎（mastitis）是指奶牛乳腺受到物理和化学因素的刺激，尤其是微生物入侵引起的炎症变化。奶牛乳腺炎一方面导致产奶量和乳制品质量的下降，给养殖场造成经济损失，另一方面在治疗过程中广泛使用抗生素等，又带来乳汁中抗生素等兽残问题。近年来的研究显示，microRNA（miRNA）在固有性免疫应答、病原体感染与免疫、以及炎症免疫调控中扮演着十分重要的作用。miRNA通过结合与其种子序列互补配对的靶基因上，引起靶mRNA降解或抑制靶mRNA的翻译，从而在转录后水平调控基因的表达。本研究，基于前期的高通量测序和转录组学分析，在健康和患乳腺炎奶牛乳腺组织中miR-145存在差异表达，因此，选择miR-145为本试验的研究对象。研究了miR-145在乳腺炎发病过程中的功能以及miR-145靶向调控PXN的分子机制。主要研究内容如下： 1.miR-145的生物信息学分析 通过MEGA7.0软件，对不同物种miR-145基因进行序列比对和构建进化树；利用RT-qPCR技术，分析miR-145在健康/患乳腺炎奶牛乳腺组织的差异表达；运用Mirdb、Targetscan、Pictar三种生物学软件预测靶基因，并进行GO/KEGG分析；利用TFBIND预测miR-145的转录因子；并结合BioGRID3.4、STRING等蛋白互作数据库，利用cytoscape构建TF-miRNA-靶基因调控网络图。结果表明，miR-145在进化上具有高度的保守性；miR-145在患乳腺炎母牛乳腺组织中表达量显著低于健康母牛（P＜0.05）；三个软件预测的靶基因交集有90个，GO富集分析显示，注释的靶基因主要参与RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录负调控、转化生长因子β受体信号通路和细胞增殖负调控等生物学过程。KEGG Pathway分析表明，靶基因主要参与上皮细胞的细菌侵入、MAPK信号转导通路和Rap1信号通路；成功构建TFs-miR-145-靶基因调控网络，并挖掘出关键的转录因子、靶基因和调控反馈回路。 2.LTA诱导型奶牛乳腺炎上皮细胞模型构建 用LTA对奶牛乳腺上皮细胞进行炎症诱导，结合ELISA和RT-qPCR试验，获得LTA诱导炎症的最佳时间和浓度。结果显示20ng/μL LTA处理奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）12h可使IL-6、TNF-α炎症因子表达水平达到最大值，完成了LTA诱导型奶牛乳腺炎上皮细胞模型的建立。 3.miR-145靶向调控PXN分子机制研究 首先，利用生物信息学预测软件发现miR-145与PXN基因存在靶向调控关系。将构建的PMIR-PXN-3'UTR的双荧光素酶报告载体以及PEZX-miR-145瞬时共转染293T细胞。结果显示：与对照组相比，miR-145+PXN组双荧光素酶活性显著低于对照组（P＜0.01）。然后，在MAC-T细胞中分别转染miR-145mimic、miR-145inhibitor和NC，通过RT-qPCR和Western blot试验检测了PXN在mRNA和蛋白水平的表达量。结果显示：与对照组相比，miR-145mimic组能显著抑制PXN在mRNA和蛋白水平的表达量（P＜0.001；P＜0.05），而miR-145inhibitor组结果相反（P＜0.001；P＜0.05）。因此，可确定miR-145能靶向调控PXN的表达。 4.炎症条件下miR-145在奶牛MAC-T中的功能研究 为探究miR-145在炎症条件下MAC-T中的功能，基于构建的炎症模型，分别转染了miR-145mimic、miR-145inhibitor和NC对照，并通过ELISA和RT-qPCR检测了白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α）两种炎性因子的水平变化，利用RTCA和流式细胞术检测了MAC-T细胞的增殖变化，通过激光共聚焦试验检测了MAC-T细胞微丝的变化。结果显示：与对照组相比，转染miR-145mimic后能够显著降低IL-6和TNF-α细胞因子的表达量（P＜0.01；P＜0.01），促进了MAC-T细胞的增值，并抑制了细胞微丝的解聚。转染miR-145inhibitor结果正好相反。 综上所述，研究表明miR-145可通过靶向调控PXN的表达，影响炎性条件下奶牛乳腺上皮细胞的表型变化，进而参与奶牛乳腺炎的发病过程。
奶牛乳腺炎;发病机制;乳腺上皮细胞;非编码RNA-145;基因表达
河南科技学院
硕士
临床兽医学
安志兴;张晓建
2019
中文
S858.23;S857.26
2019-09-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）