同核异质雄性不育小麦花粉发育的调控模型构建及育性相关基因TaUGP1--6A的功能分析
目前，杂交小麦育种是最大限度利用杂种优势提高小麦产量的一种非常有前途的策略。而细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）作为小麦杂种优势利用的主要途径，由于在作物中无法产生有功能的花粉，从而为研究细胞质遗传、生殖生长和花粉发育提供了理想的材料。近年来，我们课题组对一套理想的小麦同核异质雄性不育（Isonuclearalloplasmic male sterility lines, IAMSLs）试验材料展开研究，发现它们不育性稳定，同时具有提高小麦品质、增强抗白粉病能力、提高生长潜力等优势，是一套优良的不育系材料，在小麦的三系杂交育种中具有很大的应用潜力。 然而，这些同核异质雄性不育小麦花粉败育机理目前尚不清楚，尤其是它们核心的败育分子机制。鉴于此，本研究以该5种同核异质雄性不育系（K706A、Va706A、Ju706A、C706A和U706A ）以及他们的同型保持系B706为供试材料，对其进行了1BL/1RS核型鉴定；利用显微和亚显微技术对不育系和保持系各发育时期的植株、花药、绒毡层、小孢子和花粉壁进行了表型和细胞学观察；通过TUNEL和DNA ladder技术检测了绒毡层细胞程序化死亡（PCD）的动态变化；采用转录组测序技术对不育系败育关键时期的花药进行了差异表达分析，并利用生理指标测定和定量分析对测序分析结果进行了印证；通过RACE技术对转录组分析获得的候选基因TaUGP1-6A进行了全长扩增，并利用拟南芥功能回补和大麦花叶病毒侵染沉默（BSMV-VIGS）技术对该基因进行功能分析，获得以下主要研究结果： 1.分子标记和A-PAGE分析结果表明，5种同核异质小麦雄性不育系均为1BL/1RS核型。花粉不同发育时期（四分体时期、单核早期、单核晚期、二核期和三核期）的细胞学和表型研究表明，在整个生长发育过程中，不育系的雌蕊均发育正常，具有接受外来花粉的能力；然而不育系的雄蕊在三核时期表现出明显的干瘪、不散粉、内皮乌氏体畸形以及外表皮纤维散乱的败育特征；败育类型为典败或染败，且所占比例不同；不育系小孢子均在单核晚期开始发育紊乱，在二核期败育特征明显，然而败育的原因不同；组织切片、TUNEL和DNA ladder进行了绒毡层降解观察和PCD的检测表明，不育系K706A的花药绒毡层发生了提前降解，其余不育系均发生了延迟降解；超微结构观察表明，不育系绒毡层在单核晚期造油体的缺失以及绒毡层小体的畸形，小孢子花粉外壁无法正常合成孢粉素。以上结果均说明败育关键时期为单核晚期和二核期，绒毡层PCD的异常、造油体缺失以及绒毡层小体的畸形是花粉败育及花粉壁无法正常合成的主要原因。 2.对5种不育系败育关键时期（二核期）花药进行转录组测序分析，共获得了109.43GB的高质量clean data。通过差异表达分析（以保持系为对照），不育系K706A、Va706A、Ju706A、C706A和U706A分别获得4294、15835、5288、20444、10136个差异表达基因，其中包含1392个差异表达基因的核心基因集（172个基因上调，1220个基因下调）。通过KOG、GO、KEGG、WGCNA分析得到了败育相关的重要通路（糖代谢、氧化磷酸化、苯丙烷生物合成、磷脂酰肌醇信号通路）以及编码关键酶（GLTP、Pectinesterase、UGPase）的重要候选基因。生理指标、组织化学分析及定量的结果表明，不育花药出现了糖和ATP含量下降、ROS过量积累、孢粉素合成受阻以及ROS诱导绒毡层异常降解的现象，同时以上育性相关通路中所涉及的基因表达下调。综合以上结果，构建了一个核心转录互作网络调控同核异质雄性不育小麦花粉败育模型。 3.以保持系 B706 花药 cDNA 为模板，克隆到 2 个小麦 TaUGP1 基因的拷贝TaUGP1-6A和TaUGP1-6B。序列比对发现存在17个差异的SNP位点，但所编码的氨基酸一致。基于转录组学分析发现，位于6A染色体上的编码UGPase的核心不育相关基因TaUGP1-6A（Traes_6AS_3A8E07254）在5种不育系中均显著下调表达。因此，利用RACE技术从B706中克隆了TaUGP1-6A的1731bp的全长cDNA序列，序列分析表明， TaUGP1-6A编码467个氨基酸，具有典型的UDPGP保守结构域。为了验证TaUGP1-6A的功能，通过构建TaUGP1-6A的过表达载体pCAMBIA3301-TaUGP1-6A，对拟南芥纯合突变体atugp1和atugp2的杂合体（Atugp1atugp1/Atugp2atugp2）进行遗传转化。发现正常的杂合体后代有不育株（atugp1atugp1/atugp2atugp2）出现，而转化的植株后代均可育，说明了该基因的回补弥补了拟南芥AtUGP1基因的功能缺失，进而验证了TaUGP1-6A与育性相关。同时采用BSMV-VIGS技术，有效地沉默了B706植株中基因TaUGP1-6A的表达，出现了花药不开裂的不育表型，自交结实率降低。这些结果均表明该基因的正常表达与小麦育性紧密相关。
小麦;同核异质雄性不育;细胞程序化死亡;调控网络;TaUGP1-6A基因;功能分析
西北农林科技大学
博士
作物学
宋喜悦
2019
中文
S512.103
2020-04-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）