突变型pVenus-cdc25b表达载体的构建及其功能初探
Cdc25b（cell division cycle25b）,细胞分裂周期25b磷酸酶,cdc25磷酸酶家族成员之一，是一种Thr/Tyr双特异性蛋白磷酸酶，在哺乳动物细胞周期调控过程中起到逆转抑制磷酸化的作用。在生殖细胞的减数分裂恢复过程中，cdc25b可以使细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase）CDK1上14/Thr和15/Tyr上发生去磷酸化，从而导致CDK1活性恢复与周期蛋白CyclinB结合发挥功能，启动细胞分裂的进行。Cdc25b蛋白磷酸酶上有两种特异性的短序列，分别是核定位和核输出信号，在细胞质和细胞核的动态穿梭过程中发挥功能，该蛋白磷酸酶在细胞减数分裂启动之前由细胞质进入细胞核，细胞减数分裂恢复由细胞核输出进入细胞质。同时，cdc25b蛋白磷酸酶活性受到磷酸化或去磷酸化作用的调节，在cdc25b上也存在有相应的磷酸化修饰位点149位Ser和321位Ser,蛋白激酶PKA（protein kinase A）通过磷酸化或去磷酸化作用对cdc25b上的这两个位点进行修饰从而调控该酶活性，维持或解除细胞减数分裂的阻滞，进一步来调节细胞周期的进程。 本研究采用分子生物方法提取雌性小鼠卵巢组织RNA反转录为cDNA，进行小鼠cdc25b基因的扩增和pVenus-cdc25b真核表达载体的构建；结合蛋白组学技术对cdc25b上PKA结合的特异性磷酸化位点进行分析，实现基因定点修饰以及构建突变型载体过表达cdc25b基因；将野生型pVenus-cdc25b-WT和突变型pVenus-cdc25b-Mut真核表达载体转染体外培养的293T细胞和Hela细胞，对其功能进行了初步验证。结果如下： 1.运用特异性扩增引物扩增出小鼠cdc25b基因，完成了pVenus-cdc25-WT真核表达载体构建，对pVenus-cdc25-WT野生型质粒经Hind III和BamH I双酶切和测序分析鉴定，表明成功扩增出小鼠cdc25b基因。 2.对cdc25b蛋白磷酸酶上第30位、149位、321位、351位丝氨酸位点突变，完成pVenus-cdc25b-S351A，pVenus-cdc25b-S321A，pVenus-cdc25b-S149A，pVenus-cdc25b-S321A-S149A，pVenus-cdc25b-S30A突变载体的构建，经Hind III和BamH I双酶切检测和测序分析，结果显示：cdc25b上第30位、149位、321位、351位已由原来的丝氨酸Ser突变为丙氨酸Ala，成功实现对cdc25b磷酸酶特异性位点的突变。 3.利用重组质粒pVenus-cdc25b-WT和pVenus-cdc25b-Mut分别对培养的293T细胞和Hela细胞进行转染，结果显示：pVenus空载和pVenus-cdc25b-WT转染之后，cdc25b磷酸酶主要在两种细胞的胞质中定位表达，只有少量在胞核定位表达；而pVenus-Cdc25b-Mut转染之后，cdc25b磷酸酶均只在两种细胞的胞核中定位表达，而胞质中未见定位表达。 结论：本试验成功突变了小鼠cdc25b基因特异性磷酸化位点，构建了pVenus-cdc25b各型突变载体。对突变载体转染体外培养的293T细胞和Hela细胞结果表明，cdc25b磷酸酶在细胞的分裂过程中是一个质核穿梭的动态过程，当cdc25b磷酸酶上特异性磷酸化位点发生突变之后，核定位和核输出序列功能改变出现明显的胞核滞留现象。
哺乳动物;细胞分裂周期25b磷酸酶;蛋白激酶;生物活性
西北农林科技大学
硕士
基础兽医学
卿素珠;雷安民
2019
中文
Q959.803
2019-09-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）