J亚群禽白血病病毒诱导鸡免疫耐受的致病机制研究
J亚群禽白血病病毒（ALV-J）是一种致瘤性逆转录病毒，在临床上主要诱发肉鸡和蛋鸡发生髓系细胞白血病和其它各种类型的肿瘤性疾病。自1991年该病毒被发现以来，ALV-J在全世界范围内的各种鸡群中广泛流行并呈现间歇性爆发之势，曾对世界范围内的养鸡业造成了毁灭性打击。目前，ALV-J在中国各品系鸡群中的感染相当普遍，给家禽养殖业带来了巨大的经济损失。除了造成鸡的生产性能下降和诱发肿瘤外，一个更为严重但也容易被忽视的问题是ALV-J感染会造成被感染鸡出现严重的免疫耐受，且免疫耐受是肿瘤形成和机会性感染的必要条件。遗憾的是，迄今为止人们对ALV-J诱导免疫耐受的根本原因和机制知之甚少，所以阐明ALV-J诱导宿主免疫耐受的发病机制对防控该病具有现实而重要的意义。本研究通过建立ALV-J免疫耐受感染实验模型，从发育学、细胞学、免疫学及分子生物学角度明确ALV-J感染鸡的免疫状况及其与免疫耐受形成之间的内在联系；利用现代生命科学前沿技术，检测和分析了ALV-J感染细胞内相关蛋白的表达差异，明确其在B细胞发育和功能相关信号通路中的作用，并对ALV-J的分子致病机制进行理论概括。 为研究先天性感染与后天感染诱导免疫耐受的差异，本研究分别通过胚内注射ALV-J模拟先天感染和雏鸡注射ALV-J模拟后天感染的方式建立了实验模型。研究发现，ALV-J胚内感染可造成被感染鸡出现持续性病毒血症但没有抗体反应（即免疫耐受），而雏鸡时感染ALV-J则只有一部分鸡表现为免疫耐受。 通过ELISA检测发现免疫耐受鸡血液中总免疫球蛋白（IgM和IgG）水平显著降低。进一步运用免疫组织化学法检测了免疫耐受鸡免疫器官中IgM+和IgG+B细胞的数量和发育动态，检测和评价了被感染鸡脾脏B细胞应对胸腺非依赖型抗原脂多糖（LPS）刺激后的活化与增殖能力。结果显示，免疫耐受鸡体内的B细胞向IgM+和IgG+抗体生成细胞（特别是IgG型细胞）发育和分化的能力受到严重的抑制；脾脏生发中心B细胞应对有丝分裂原刺激后活化与扩增能力也被抑制。为了解ALV-J先天感染与后天感染鸡对特异性抗原刺激的免疫应答能力的差异，进一步检测了宿主应对绵羊红细胞（SRBC）及马立克氏病病毒（MDV）减毒1型疫苗刺激所产生的IgM型和IgG型抗体滴度。结果显示，先天感染鸡所产生的抗原特异性IgM型和IgG型抗体滴度显著降低；然而，虽然后天感染鸡体内抗原特异性IgG型特异性抗体滴度显著降低，但IgM型抗体滴度基本正常，这些数据提示ALV-J后天感染对鸡体内B细胞的早期发育影响不大。综合以上实验结果可知，ALV-J先天感染抑制了B细胞的发育及成熟，并抑制了B细胞免疫球蛋白的生成和抗体类别转换能力。 为了进一步探明ALV-J先天感染诱导免疫耐受的细胞学机制，本研究检测了自鸡胚发育到雏鸡的各时段法氏囊B细胞发育动态。细胞形态学检测结果显示，ALV-J胚内感染鸡法氏囊发育严重不良且大部分淋巴滤泡不能分化为明显的髓质和皮质，提示这些淋巴滤泡处于幼稚状态；然而孵化后感染ALV-J的鸡法氏囊发育虽然也受到抑制，但大部分淋巴滤泡能够形成皮质部。这些结果证实ALV-J先天感染对鸡法氏囊B细胞的发育影响更大。流式细胞分析结果进一步发现ALV-J胚内感染会造成更高的B细胞感染率（约27%），且免疫组化结果显示这些gp85抗原阳性B细胞体积和核桨比例较大，大多处于发育早期阶段。以上结果说明，ALV-J的先天感染会导致了胚胎B细胞的后期发育抑制，并因此造成B细胞抗体生成障碍。流式细胞分析结果证实ALV-J阻断了法氏囊中CD117+祖B细胞的分化，并且体外实验进一步证实ALV-J抑制了CD117+B细胞体外增殖能力和应答LPS和IL-4刺激所发生的免疫球蛋白基因类别转换重组能力。综合分析以上体内外实验数据，提示ALV-J诱导的免疫耐受与B细胞发育受阻和功能障碍密切相关，而导致B细胞出现这种“无能”状态的关键原因就是ALV-J选择性作用于早期发育的B细胞并抑制它们的进一步发育和成熟。 相关ALV-J感染细胞的蛋白质组学检测结果显示，ALV-J感染改变了DF-1细胞中酪氨酸激酶Lyn的蛋白表达水平。Lyn是B细胞BCR信号通路中的核心因子，其参与了B细胞增殖、分化、成熟或耐受等相关生物学过程。因此，为明确ALV-J诱导B细胞无能的分子机制，本研究进一步分析了ALV-J对B细胞中Lyn的表达调控及对BCR信号转导的影响。Western-blot及免疫组织化学检测结果显示，ALV-J胚内感染鸡法氏囊细胞中的Lyn表达水平上升。因体内实验显示ALV-J感染鸡B细胞中Lyn表达异常，本研究进一步在体外实验中研究了ALV-J对Lyn表达的影响。通过激光共聚焦显微镜观察发现，ALV-J感染B细胞后其病毒gp85蛋白主要分布于细胞浆，同时也有一部分B细胞的胞浆和胞核均有病毒gp85的阳性信号。qRT-PCR和Western-blot检测结果与体内实验结果一致，即ALV-J感染导致B细胞内Lyn的mRNA转录水平和蛋白合成水平均被上调。 Lyn在BCR信号转导中同时具有正调控和负调控作用，而这种正负调控作用取决于其不同磷酸化位点的活化水平。为明确Lyn在ALV-J感染组B细胞中发挥的主导作用，本研究进一步检测了BCR信号激活后Lyn蛋白的磷酸化水平及其下游直接底物Syk蛋白的磷酸化水平。流式细胞术分析结果显示，当激活BCR信号后，感染组B细胞中Tyr397位点（激活正调控作用）和Tyr507位点（激活负调控作用）的磷酸化水平均不同程度的增强。此时，作为BCR信号转导的核心激酶同时也是Lyn的直接底物Syk的磷酸化水平就显得尤为重要。流式细胞分析结果显示，此时S yk的磷酸化水平显著下降，提示Lyn在感染组B细胞中主要发挥了抑制BCR信号转导的作用。为了确证这种作用，本研究进一步对B细胞中的Lyn进行了shRNA干扰并检测了相关蛋白的磷酸化水平。检测结果显示，对感染组B细胞实施Lyn的shRNA干扰后，其下游蛋白Syk的磷酸化水平显著回升。以上实验数据进一步说明Lyn在感染B细胞中发挥了抑制BCR信号转导的作用，从而导致了B细胞BCR信号级联反应受阻。 综上所述，ALV-J诱导的免疫耐受与B无能有关，其根本原因在于ALV-J阻滞了CD117+祖B细胞的发育和分化；而导致B细胞发育和分化障碍的分子机制是ALV-J激活了Lyn在BCR信号转导中的抑制性作用。总之，本研究从细胞和分子两个维度全面解析了ALV-J诱导免疫耐受机制，为禽白血病的防控及揭示相关病毒诱导免疫耐受的机制研究提供了理论依据。
鸡J亚群禽白血病病毒;免疫耐受;致病机制
山东农业大学
博士
基础兽医学
成子强
2019
中文
S858.31;S857.4
100
2019-08-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）