白藜芦醇通过SIRT1/ATF6调节脂滴蓄积的作用及机制研究
背景： 代谢综合征（metabolic syndrome, MetS）是一种以中心性肥胖、非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）、高血压、糖脂代谢异常等为主要临床表现的代谢异常疾病。MetS所引发的死亡率不断攀升，已成为严重危害我国居民健康和社会发展的重大公共卫生问题。研究发现，肥胖尤其是中心性肥胖是 MetS 的共同病理基础，表现为过多脂肪在代谢靶器官（肝脏、脂肪组织等）蓄积。脂滴（lipid droplets, LDs）是产生自内质网的一种高度动态的细胞器，其主要生理功能是储存中性脂质。LDs 在肝脏和脂肪组织中含量最为丰富，LDs 形成、融合及蓄积过程是 MetS 发生发展的重要环节。内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）导致的未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）不仅促进LDs形成，同时也影响LDs在肝脏和脂肪组织中的融合和蓄积，已成为调节代谢靶组织中LDs蓄积的重要干预靶点。 大量证据表明，生活方式改变尤其是膳食结构西化导致的营养与代谢失衡是MetS高发的关键原因，而膳食营养干预已经成为MetS预防和控制的最简单、最实用途径。研究发现，植物性食物摄入与 MetS 的发生呈显著负相关，其健康效应的功效成分主要是植物化学物，植物化学物已经成为防治 MetS 的重要膳食营养干预策略。本实验室在前期研究中，开展了白藜芦醇（resveratrol，RSV）对MetS人群和高脂饮食（high fat diet, HFD）诱导动物模型的干预研究，发现RSV能明显改善MetS人群及模型动物的脂代谢，但其作用机制尚不清楚。结合国内外相关研究，本研究提出了“RSV 可能通过影响肝脏和脂肪组织LDs蓄积改善MetS ”的理论假说。本课题旨在通过HFD干预的动物模型和体外实验，研究RSV对肝脏（肝细胞）和脂肪组织（脂肪细胞）LDs蓄积及LDs相关基因表达的影响，并深入研究RSV通过调控沉默信息调节子（silent mating-type information regulation 2 homolog 1, SIRT1）与ATF6（UPR的关键基因）的相互作用，进而调节LDs相关基因（Fsp27、CREBH等）表达，减少LDs在肝脏（肝细胞）和脂肪组织（脂肪细胞）蓄积的作用机制。本研究将为RSV预防MetS提供新的实验证据，同时为MetS的防治提供新的干预靶点。 目的： 阐明RSV对肝组织和脂肪组织LDs蓄积的调节作用，及其通过SIRT1/ATF6介导的相关信号通路调节LDs蓄积相关基因表达及减少LDs蓄积的作用机制，为RSV改善MetS提供新的科学证据。 方法： 1.利用HFD喂养C57野生型（wildtype, WT）和SIRT1基因敲减型（knockdown, KD）小鼠，并给予400mg/kg/d的RSV灌胃30天。记录各组小鼠体重、摄食量，试剂盒检测血脂谱，HE 染色、油红 O 染色、激光共聚焦、磁共振（MRI）等方法检测肝脏和脂肪组织的LDs蓄积程度和病理改变，，qRT-PCR和Western blot法分别检测小鼠肝脏和脂肪组织中ERS相关基因（GRP78）、UPRER相关基因（PERK、IRE-1、ATF6）及 LDs 蓄积相关基因（Fsp27、PLIN1、CREBH）的表达水平，以阐明 RSV 对 HFD诱导小鼠肝脏和脂肪组织LDs蓄积的影响及SIRT1在RSV调节LDs相关基因表达中的作用。 2.利用小鼠原代肝细胞和HepG2细胞株，建立棕榈酸（palmitic acid, PA）诱导肝细胞脂质蓄积模型。体外培养前脂肪细胞3T3-L1，并诱导其分化为脂肪细胞。肝细胞和脂肪细胞分别给予不同浓度RSV干预，CCK-8法检测细胞活力，油红O染色和免疫荧光细胞化学法检测细胞内LDs蓄积。检测RSV对肝细胞和脂肪细胞ERS相关基因（GRP78）、UPRER相关基因（PERK、IRE-1、ATF6）及LDs蓄积相关基因（Fsp27、PLIN1、CREBH）表达水平的影响。进一步使用SIRT1和ATF6的siRNA以及SIRT1或ATF6的过表达质粒转染肝细胞和脂肪细胞，并检测SIRT1或ATF6基因表达沉默或过表达后RSV对LDs蓄积的影响，以阐明RSV通过SIRT1、ATF6对肝细胞和脂肪细胞LDs蓄积及相关基因表达的调节作用。 3. 进一步利用免疫共沉淀实验（Co-IP）和邻位连接实验（PLA）检测RSV对SIRT1和ATF6结合的影响；通过乙酰化抗体及免疫沉淀方法检测RSV通过SIRT1对ATF6蛋白翻译后乙酰化修饰的影响；通过染色质免疫沉淀技术（ChIP）和双荧光素酶报告基因检测RSV通过ATF6对SIRT1转录调节的作用；最终阐明RSV对SIRT1与ATF6相互作用的调控机制。 结果： 1. RSV可有效改善HFD诱导小鼠肝脏和脂肪组织的脂质蓄积，并调节LDs蓄积相关基因表达，该作用与其对内质网应激和未折叠蛋白反应的抑制作用有关，而SIRT1体内敲减后该作用被消除。 研究发现，RSV干预可显著抑制HFD诱导的WT小鼠体重和肝脏重量增加，改善血脂谱和肝脏脂质蓄积，降低肝脏TG含量。HFD处理后WT小鼠肝脏和脂肪组织的ERS标志蛋白GRP78表达增高，UPRER被激活且PERK、IRE-1、ATF6等相关蛋白表达增高；而RSV干预可上调SIRT1表达，并降低ERS水平及GRP78和ATF6的表达，但是对PERK、IRE-1的表达无明显影响。体内敲减SIRT1后，RSV对LDs蓄积及其对GRP78和ATF6表达的抑制作用被削弱。 2. RSV可显著抑制PA或诱导剂分别处理的肝细胞和3T3-L1脂肪细胞的脂质蓄积，上调SIRT1基因表达，降低ERS标志蛋白GRP78及UPRER相关基因ATF6的表达水平。转染SIRT1 siRNA或ATF6过表达质粒后，RSV对LDs蓄积的抑制作用被削弱，GRP78和ATF6的表达被抑制；而转染SIRT1过表达质粒或ATF6 siRNA后，RSV对LDs的蓄积作用及GRP78和ATF6表达显著增强。 研究发现，PA能够诱导肝细胞LDs蓄积，而3T3-L1脂肪细胞成脂分化也使细胞内LDs增加，同时ERS水平升高，UPRER被激活。RSV分别处理PA诱导的肝细胞和诱导剂处理的脂肪细胞后，能够抑制肝细胞和脂肪细胞的细胞活力降低和细胞内LDs蓄积，并降低ERS和UPRER水平及Fsp27、CREBH、PLIN1、ATF6等相关基因表达，但对PERK和IRE-1基因表达水平没有显著影响。SIRT1 siRNA转染肝细胞和脂肪细胞后，RSV对LDs的蓄积作用被削弱，而SIRT1过表达使RSV的效应显著增强。进一步使用ATF6 siRNA后，RSV对肝细胞和脂肪细胞LDs蓄积的抑制作用更显著，而转染ATF6过表达质粒后的RSV的作用被削弱。 3. RSV可以抑制ATF6与SIRT1的结合，并通过SIRT1促进ATF6蛋白的去乙酰化和失活化，抑制ATF6对SIRT1的转录抑制作用，并通过该正反馈调节机制增加SIRT1表达，进而抑制LDs蓄积相关基因表达，减少LDs在肝脏和脂肪组织的蓄积。 研究发现，ATF6 siRNA转染细胞导致RSV处理后SIRT1的mRNA和蛋白质表达水平显著增强，而ATF6过表达导致RSV处理细胞的SIRT1表达水平降低，表明ATF6在RSV调节靶细胞SIRT1表达中发挥转录抑制作用。通过Co-IP和PLA实验，发现RSV抑制了PA诱导肝细胞中SIRT1和ATF6之间的结合作用。使用抗乙酰化抗体并通过免疫沉淀检测发现，RSV处理细胞后ATF6的乙酰化水平降低，提示RSV可能通过SIRT1促进ATF6的去乙酰化。通过双荧光素酶报告基因检测发现，沉默ATF6能够显著增强RSV诱导的SIRT1转录活性，而ATF6的过表达则抑制SIRT1转录活性。进一步采用ChIP检测发现，在SIRT1启动子区域内存在ATF6的潜在的结合位点，表明RSV对SIRT1转录调节可能是通过ATF6介导。以上结果表明RSV可能通过抑制ATF6与SIRT1结合，同时可通过SIRT1促进ATF6的去乙酰化而失活化，削弱ATF6对SIRT1的转录抑制作用并增加SIRT1转录表达水平，从而影响LDs蓄积相关基因的表达，抑制LDs蓄积。 结论： 本课题研究结果提示，RSV能够在肝脏（肝细胞）和脂肪组织（脂肪细胞）中通过SIRT1促进ATF6的去乙酰化和失活化，削弱ATF6对SIRT1的转录抑制作用并上调SIRT1的转录水平，进而抑制LDs标志基因Fsp27的表达，减少LDs在肝脏（肝细胞）和脂肪组织（脂肪细胞）中的蓄积，延缓MetS进程。
非酒精性脂肪性肝病;白藜芦醇;SIRT1基因;ATF6基因;脂滴蓄积
陆军军医大学
博士
营养与食品卫生学
糜漫天
2018
中文
R575.5
2019-07-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）