杜鹃兰假鳞茎串“分枝”发育机制研究
杜鹃兰（Cremastra appendiculata (D. Don) Makino）为兰科（Orchidaceae）杜鹃兰属（Cremastra）多年生珍稀药用植物。以其干燥假鳞茎入药，具有清热解毒，润肺止咳，活血化瘀等功效。其假鳞茎中含有丰富的活性分子，特别是近些年发现了多种抗肿瘤活性成分而受到国内外广泛关注。然而，杜鹃兰存在严峻的资源问题：自然条件下种子结实率不到 5%，且种子无胚乳，种胚仅有一团未分化成熟的细胞构成，致使在自然条件下几乎不能进行有性繁殖。杜鹃兰假鳞茎则几乎成为其唯一的繁殖器官。遗憾的是，每年仅由其一年生假鳞茎萌发1个芽，长成1个新的假鳞茎，逐年形成假鳞茎串。假鳞茎串中其它假鳞茎上的侧芽因受到抑制而未进行分枝生长，致使其繁殖系数极低。且有关地下茎的分枝发育调控机制鲜有报道。因此，探明杜鹃兰假鳞茎串“分枝”发育的调控机制，以期为破除侧芽被抑制提供新思路，进而为杜鹃兰分子育种和地下茎分枝发育研究奠定理论基础。本文以三年生杜鹃兰为材料，研究了杜鹃兰侧芽形态发生过程及其休眠规律;以打顶和生长素运输抑制剂处理杜鹃兰假鳞茎串从转录组水平、基因表达水平以及激素水平分析探讨了生长素、细胞分裂素和独角金内酯互作调控杜鹃兰假鳞茎串分枝发育的内在机制。主要研究结果如下： 1. 利用光镜和扫描电镜的显微结构分析技术，并结合qRT-PCR分析手段，研究了侧芽的休眠规律。结果表明，打顶诱导了侧芽萌发;显微结构分析发现，侧芽基部的薄壁组织细胞在侧芽萌发过程中发生了明显变化，即从休眠期的皱缩形态逐渐变成圆润饱满的形态;水分检测结果表明，侧芽萌发过程中其自由水含量逐渐增加，束缚水含量先减少后稍有增加;qRT-PCR 检测发现，细胞壁扩张蛋白基因 αEXPA1、EXPA2、EXPA6以及水通道蛋白基因PIP1-2和PIP2表达上调，而液泡膜上的水通道蛋白基因δTIP表达下调。因此，杜鹃兰侧芽休眠可能是由某些因子调控细胞壁修饰蛋白及水通道蛋白的转录水平，从而营造侧芽内低自由水胁迫环境，诱使侧芽进入休眠。 2. 探讨了打顶对侧芽萌发过程中的生理变化，并通过外源激素（ZT和GA3）处理侧芽进一步证实植物激素在调控侧芽破出的作用。研究结果表明，打顶后侧芽内IAA水平明显降低（P<0.05），然而侧芽萌发后，IAA水平有所升高，但仍显著低于对照（P<0.05）;CTK水平变化趋势与IAA水平变化相反;在侧芽萌发过程中，无论是对照组还是打顶组ABA水平都是下降的，只是打顶组下降得更快，打顶15 d后，较对照达到显著水平（P<0.05）;GA3是逐渐升高的，打顶15 d后显著升高（P<0.05）;外用玉米素分别诱导了51.67%二年生假鳞茎上的侧芽萌发和35.00%的三年生假鳞茎上的侧芽萌发;外用GA3 并未诱导侧芽萌发;另外，qRT-PCR 分析发现，打顶后 CaIPT 表达量显著升高（P<0.05）。上述结果说明，IAA水平降低和CTK水平升高是杜鹃兰侧芽萌发的必需条件，且可能通过IAA控制CaIPT基因的表达来调控芽中CTK水平，从而控制杜鹃兰侧芽破出;GA3和ABA水平的变化与杜鹃兰侧芽生长有关，但它们的水平变化不是侧芽破出所必需的。 3. 转录组测序数据的生物信息学分析预测了杜鹃兰分枝发育的调控途径。分析结果表明，转录测序获得了 597,053,172 条高质量的基因片段（clean reads），组装成了239,732条平均长度为921 bp的基因（unigenes）。与7大公共数据库进行mapping，有179,559条基因（74.90%）是高度相似的。对获得的5,988个DEGs进行GO和KEGG富集分析，均显著富集在激素信号转导和激素代谢上，说明植物激素在调控杜鹃兰侧芽破出中发挥重要作用。进一步对生长素、细胞分裂素和调控分枝发育相关转录因子的DEGs进行表达热图分析，发现在TD2时期，生长素降解代谢酶基因（CaDAO）、细胞分裂素合成关键酶基因（CaIPT 和 CaCYP735A）、维持分生组织细胞活性的调控子（CaWUS）和分枝的正调控因子（CaWRKY71）是高表达的，而分枝负调控因子（CaBRC1）低表达;在TG2时期，生长素合成关键酶基因（CaYUCCA）和细胞分裂素降解代谢关键酶基因（CaCKX）高表达，而CaDAO、CaIPT、CaCYP735A和CaWRKY71基因低表达。在此期间，生长素和细胞分裂素信号转导途径中有其特异的响应分子表达。这些结果说明了生长素通过其信号转导途径调控细胞分裂素代谢关键酶基因的转录水平，从而控制细胞分裂素水平，实现间接负调控侧芽生长。 4. 通过打顶和生长素运输抑制剂处理杜鹃兰假鳞茎串，探讨了生长素负调控杜鹃兰分枝发育的机制。结果表明，在打顶、NPA和TIBA处理后，侧芽内生长素水平迅速降低;CTK水平则快速升高。qRT-PCR检测发现，分枝正调控因子CaWRKY71在侧芽转化期表达上调，而萌发期则不表达;生长素氧化降解代谢酶基因CaDAO的快速表达可能是受CaWRKY71基因诱导，进而降低了IAA水平;生长素水平降低的信号促进了细胞分裂素合成酶基因CaIPT和CaCYP735A的表达，同时抑制了独角金内酯合成关键酶基因CaCCD7和CaCCD8的表达;细胞分裂素水平升高，促进了CaWUS的表达，同时抑制分枝负调控因子CaBRC1的表达。萌发期，芽生长信号诱导了生长素合成关键酶基因 CaYUCCA 的表达;生长素水平升高的信号又促进独角金内酯合成关键酶基因（CaCCD7和CaCCD8）和细胞分裂素分解代谢酶基因CaCKX的表达，致使细胞分裂素水平降低，但依然显著高于对照（P<0.05），受其调控的分枝负调控因子 CaBRC1 仍然被抑制。由此推断，生长素通过调控细胞分裂素和独角金内酯的水平间接负调控杜鹃兰侧芽的生长。
杜鹃兰;假鳞茎串;分枝发育;生长素;细胞分裂素;独角金内酯;调控机制
贵州大学
博士
植物学
张明生
2018
中文
S567.239
2019-04-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）