褐飞虱间α胰蛋白酶抑制剂重链4的功能研究与卵巢上皮栓转录组分析
褐飞虱Nilaparvata lugens St?l属半翅目同翅亚目飞虱科，是我国乃至亚洲最为严重的水稻害虫。褐飞虱通过刺吸为害水稻，并可传播病害如水稻锯齿叶矮缩病 (Rice Ragged Stunt Virus, RRSV)等。不仅如此，褐飞虱的排泄物中含有多种氨基酸和蜜露，常常会引发霉菌滋生，使得水稻大幅度减产。到目前为止，我国防治褐飞虱的常规手段是农药防治，但这带来了褐飞虱的抗药性和环境污染等问题。作为半翅目刺吸性昆虫，褐飞虱食性单一，仅取食水稻韧皮部汁液为生，营养缺乏，但其体内存在类酵母共生菌(Yeast-like Symbionts, YLS)，可以为其提供必需氨基酸、胆固醇，并且可以加速氮循环，参与卵黄原沉淀等。在褐飞虱雌成虫羽化后2天起，脂肪体中的YLS释放到血淋巴中，并经由卵巢小管的上皮栓(epithelial plug, EP)入侵卵巢，从而进入卵母细胞，完成经卵传播，说明上皮栓在YLS经卵垂直传播中起着关键作用。课题组前期研究发现，间α胰蛋白酶基因(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4, ITIH4)在褐飞虱原羽化后第2天，表达量显著上升，说明其可能与褐飞虱生殖相关，也可能与YLS入侵卵巢有关。本文对褐飞虱ITIH4的功能进行了研究，并对卵巢上皮栓的特异基因表达进行了分析，研究结果如下： (1)克隆得到褐飞虱ITIH4基因，其开放阅读框全长2724bp，翻译907个氨基酸，等电点6.17，经SignalP预测信号肽位点在第24位氨基酸处。通过序列比对和建立系统进化树发现，ITIH4在半翅目中保守。通过NCBI检测到褐飞虱ITIH4转录出的蛋白质序列有两个结构域保守，分别是穹窿蛋白间α胰蛋白酶结构域(Vault protein inter-alpha-trypsin domain, VIT)和冯维勒布兰德因子A型(Von Willebrand factor type A, vWFA)结构域。荧光定量实验发现，褐飞虱ITIH4在若虫2龄期之间表达量最高，4龄最低，在羽化后第二天的雌成虫中显著上调。ITIH4基因表达RNA干扰后，褐飞虱死亡率非常高，在羽化的第4天死亡率累积超过87%。实验组注射后10天平均产卵量为29.4枚，比对照组降低了57.3%，实验组卵孵化率为63.5%，低于对照组(87.7%)。被RNA干扰的褐飞虱卵巢发育较未被干扰的缓慢，卵黄蛋白前体——卵黄蛋白原(Vitellogenin, Vg)以及卵黄蛋白原受体(Vitellogenin Receptor, VgR)的表达均下调，说明ITIH4可能协调上述基因而影响褐飞虱生殖。结合产卵量与孵化率统计，推测ITIH4的干扰会阻止Vg的形成和累积，从而影响褐飞虱卵的发育，甚至致死；昆虫卵黄沉淀受保幼激素(juvenile hormone, JH)调控，保幼激素受体(Methoprene-tolerant, Met)在褐飞虱体内介导保幼激素的行为。经荧光定量PCR检测保幼激素受体表达量，除注射第3天的试虫外，并没有发现显著差异。KEGG通路分析显示，调控Vg及卵巢发育的基因如胰岛素生长因子IGF、转化生长因子TGFB等与ITIH4在大分子的胞吞作用中可能存在共表达。综上所述，ITIH4在褐飞虱生殖过程中对卵巢的发育和卵黄蛋白原的合成、累积起重要作用。 （2）解剖获得褐飞虱卵巢的卵巢小管柄(petiole)、上皮栓、卵泡(follicle)等3个组织的滤泡细胞，进行Illumina转录组高通量测序，对上皮栓的特异表达基因进行筛选和分析。本研究应用高通量测序，获得78427277条序列，平均长度517bp，经Trinity法拼接组装后将这些基因与公共数据库(KEGG, KOG, Pfam, NR和SWISS-Prot)对比后，注释了151422条基因。通过分析注释数据，发现上皮栓处有关内膜(endosome membrane)、胞吞作用(endocytosis)、细胞质膜结合囊泡(cytoplasmic membrane-bounded vesicle)的基因表达显著高于卵泡和卵巢小管柄，推测这些基因可能是有关YLS侵入卵巢部位有关。其中DNAJC1、TGFBR1等蛋白与ITIH4可能存在互作。
褐飞虱;间α胰蛋白酶抑制剂重链4;卵巢上皮栓转录组;基因克隆;产卵量
中国计量大学
硕士
生物化学与分子生物学
俞晓平;许益鹏
2018
中文
S433.3
2019-04-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）