多基因植物转化载体对烟草和欧美杨107杨的遗传转化
为了实现多基因对烟草和杨树的遗传转化，本研究将多基因植物转化载体p209-BtCry1Ac-BADH和p209-BtCry1Ac-BtCry3A-BADH导入农杆菌中，利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草（wisconsin35），获得了经PCR、荧光定量PCR检测的转基因植株，毒蛋白检测和抗性试验证明载体转化植物后，目的基因能够表达，并且转基因植株表现出一定的抗性。在此基础上进一步转化欧美杨107杨，获得了经PCR初步检测的转基因株系。主要研究结果如下： 1.p209-BtCry1Ac-BADH载体对烟草的遗传转化及表达检测。 确定了烟草遗传转化中分化培养基中硫酸卡那霉素（Kan）的筛选浓度为50mg·L-1，生根培养基中Kan的筛选浓度为75mg·L-1，在筛选过程中头孢噻肟钠（Cef）的使用浓度为400mg·L-1。 利用农杆菌介导法转化烟草后，获得了经Kan筛选的完整再生植株。经PCR检测证明，4个株系中检测到BtCry1Ac和BADH基因；2个株系只检测到BtCry1Ac基因。 荧光定量PCR检测表明，检测到所有目的基因的株系中有3个株系的2个目的基因均在转录水平得到表达，且存在表达差异，有1个株系未检测到BADH基因的表达。只检测到BtCry1Ac基因的2个株系均检测到目的基因的表达。 ELISA毒蛋白检测表明，经荧光定量PCR筛选的3个株系均检测到BtCry1Ac毒蛋白的表达，含量最高为414.63ng·g-1，只检测到BtCry1Ac基因的2个株系也检测到毒蛋白。 室内饲虫试验表明，3个转基因株系中只有2个株系对斜纹夜蛾幼虫表现出抗虫性，校正死亡率最高为38.2%，其余均没有表现出明显抗虫性。选取2个株系进行组培苗耐盐试验，表明在不同NaCl浓度下，转基因株系与对照之间没有明显差异。 2.载体p209-BtCry1Ac-BtCry3A-BADH对烟草的遗传转化及表达检测。 利用农杆菌介导法转化烟草后，获得了经Kan筛选的完整再生植株。经PCR检测证明，7个株系中检测到BtCry1Ac、BtCry3A和BADH三个基因；1个株系检测到BtCry1Ac和BtCry3A基因；1个株系只检测到BtCry1Ac基因。 荧光定量PCR检测表明，检测到所有目的基因的株系中有4个株系的3个目的基因在转录水平得到表达且存在表达差异，有3个株系未检测到BADH基因的表达。检测到BtCry1Ac和BtCry3A基因的株系检测到目的基因的表达，只检测到BtCry1Ac基因的株系也检测到目的基因的表达。 ELISA毒蛋白检测表明，经荧光定量PCR筛选的4个株系均检测到BtCry1Ac和BtCry3A毒蛋白的表达，BtCry1Ac毒蛋白的含量最高为267.90ng·g-1，BtCry3A毒蛋白的含量最高为13749.30ng·g-1，BtCry3A毒蛋白含量明显高于BtCry1Ac毒蛋白。另外3个只检测到BtCry1Ac和BtCry3A基因表达的株系也检测到BtCry1Ac毒蛋白，含量最高为369.92ng·g-1，其中2个株系检测到BtCry3A毒蛋白，含量最高为3262.86ng·g-1。其余部分株系也检测到毒蛋白。 室内饲虫试验表明，7个转基因株系对斜纹夜蛾幼虫均具有抗性，校正死亡率最高为69.5%，其他检测到BtCry1Ac基因的株系对斜纹夜蛾幼虫也具有抗性，校正死亡率最高为59.3%。选取2个株系进行组培苗耐盐试验，表明在不同NaCl浓度下，转基因株系与对照之间没有明显差异。 3.多基因植物转化载体对107杨的遗传转化。 通过外植体培养，获得无菌107杨组培苗，经分化和生根交替繁殖，生长良好。确定了107杨遗传转化中分化培养基中Kan的筛选浓度为30mg·L-1，生根培养基中Kan的筛选浓度为50mg·L-1，在筛选过程中Cef的使用浓度为400mg·L-1。采用农杆菌介导法，将两个植物转化载体分别转化107杨，获得了经Kan筛选的完整再生植株。经PCR初步检测，获得10个转p209-BtCry1Ac-BADH的转基因株系和4个转p209-BtCry1Ac-BtCry3A-BADH的转基因株系。
多基因;植物转化载体;烟草;欧美杨107杨;遗传转化
河北农业大学
硕士
林木遗传育种
杨敏生
2013
中文
S572;S792.11
2019-01-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）