胰敏素(INSR-IgG4Fc重组蛋白)对胰岛素抵抗的改善作用及机制研究
世界卫生组织的报告表明，目前世界上超重人数达14亿之多，而肥胖者超过5亿。随着经济发展，我国的肥胖人数呈快速增长和低龄化的趋势，目前我国的肥胖人口已经超过9000万人。肥胖是引起2型糖尿病(T2DM)和心血管疾病的主要危险因素。据预测，到2025年糖尿病的发病率将达到全世界人口的6.1%，所以如何有效治疗糖尿病，提高病人的生存质量是当今急需解决的研究内容。 2型糖尿病是一种多因素的代谢型疾病，具有胰岛β细胞功能缺失，胰岛素抵抗，肝糖异生增加等特点。胰岛素抵抗的主要特点为胰岛素对靶器官组织的代谢调节功能的敏感性降低，是肥胖性糖尿病和心血管疾病之间最重要的介导因子。胰岛素抵抗使骨骼肌、肝脏、肾、脂肪组织的葡萄糖利用率降低或者葡萄糖转运能力降低，导致的葡萄糖脂质代谢改变引起高糖血症，是引起2型糖尿病继发性并发症的首要因素。因此，治疗2型糖尿病的关键是提高胰岛素敏感性，靶向增加葡萄糖摄取和降低糖异生。 胰岛素受体激活后作用于其下游的18个靶标蛋白，其中包括Akt和ERK等。研究发现一种称为通路选择性的胰岛素抵抗和反应模式(SEIRR)，即糖尿病患者的肝脏在胰岛素的刺激下对脂肪降低和葡萄糖降低的通路激活不足，但是却能够激活脂肪生成和MAP激酶通路。这一差异选择性的激活和抑制，使所有降低血脂和血糖的通路都受到抵抗，而脂肪生成和MAP通路却仍然对胰岛素产生激活效应。这种联合效应对人类健康产生了巨大威胁。因此，发生胰岛素抵抗时，SEIRR将会导致异常脂蛋白血症和高糖血症，从而出现粥样动脉硬化性等心血管疾病。这些心血管疾病仍然是糖尿病患者致死的主要原因。但是到目前为止SEIRR及其并发症的分子机理仍然不清楚。这些复杂的机理的不确定性严重阻碍了我们对糖尿病的大部分致命性并发症的病理生理机制的了解。并且，目前还没有开发出特异性的治疗药物来纠正SEIRR。 目前临床上常用的胰岛素增敏剂有化学合成的罗格列酮和吡格列酮，属于过氧化物酶增殖体激活受体(PPAR)的激动剂，主要作用机制是使细胞膜上胰岛素受体对胰岛素的敏感性增加，促进细胞对葡萄糖利用，但长期服用会增加心肌梗死或中风等缺血性心血管意外。所以迫切需要开发新的副作用更小的药物来提高胰岛素受体的敏感性。以往的数据表明，发生胰岛素抵抗时，外周的胰岛素仍然是具有生物学效应，但是由于胰岛素受体与胰岛素结合的亲和力和敏感性降低，使胰岛素受体的胞内段酪氨酸基团磷酸化受阻，导致一系列的细胞内信号生物链发生紊乱。另外，研究发现血液中存在细胞外游离于血液中的胰岛素受体，游离状态的胰岛素受体能低亲和力地与胰岛素结合。并且肥胖及2型糖尿病动物血中存游离胰岛素受体浓度增加，可能游离胰岛素受体结合胰岛素后并不能把胰岛素带入靶细胞内，也不能激活胰岛素信号通路。虽然胰岛素与在游离状态下的胰岛素受体低亲和力结合，但是在游离胰岛素受体数量增加的情况下仍然可能降低胰岛素对胰岛素受体的刺激作用。 首先我们构建了一种新的重组蛋白，该蛋白具有人胰岛素结合序列与人IgG4的Fc片段，这种重组蛋白具有高亲和力的胰岛素受体的胰岛素结合结构域，并且该重组蛋白与与胰岛素结合后形成的二聚体能够进入到胰岛素靶器官细胞内激活胰岛素信号通路，从而重新焕发胰岛素的功能。命名这个新的蛋白为胰敏素。 随后从体内体外试验证明胰敏素能够提高胰岛素抵抗细胞对胰岛素的敏感性，激活Akt/ERK信号通路，抑制糖异生及促进糖原合成，有效改善体外细胞和高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠对胰岛素的敏感性。胰敏素的研究将为改善胰岛素抵抗相关药物开发提供新的线索。 第1章胰敏素重组蛋白的构建及纯化 目的：构建含有胰岛素结合序列及IgG4Fc片段的重组蛋白，命名该重组蛋白为胰敏素，并进行体外哺乳动物细胞表达。 方法：(1)构建表达INSR-IgG4Fc重组蛋白，命名为胰敏素，测序验证。(2)进行哺乳动物细胞体外表达，利用亲和层析柱纯化该胰敏素蛋白，应用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定胰敏素蛋白纯度和蛋白分子量大小。(3)确定胰敏素在肝细胞的最佳作用浓度和最佳作用时间。 结果：(1)成功构建了哺乳动物细胞系的胰敏素表达载体，应用SDS-PAGE测定其分子量大小为33 kD。(2)在培养的肝细胞体系中，胰敏素能够显著激活Akt磷酸化，其最佳作用浓度为5nM，最强作用时间为20 min。 小结：(1)成功构建了全新的纯人源性的重组蛋白INSR-IgG4Fc，即胰敏素。(2)胰敏素可以促进Akt的磷酸化，最佳作用浓度是5nM，最佳作用时间是20分钟。 第2章胰敏素对肝细胞胰岛素抵抗的改善及其机制 目的：观察胰敏素对软脂酸诱导的肝细胞胰岛素抵抗的改善，探讨其作用机制。 方法：(l)胰岛素抵抗细胞模型的建立及应用：用0.3mM软脂酸处理肝细胞16h构建胰岛素抵抗细胞模型，利用Westem blot检测胰岛素对胰岛素信号通路分子Akt的激活情况，以确定模型构建成功。(2)观察胰敏素对胰岛素抵抗肝细胞的作用：利用ELISA检测糖原、G6P和PEPCK的含量，利用qPCR检测糖异生相关调控基因SIRT1、PPARy、PGC-Iα和PGC-1β的mRNA表达，利用Westem blot检测胰岛素通路IRS-1、Akt、ERK、JNK的激活状态。(3)利用PI3K特异性抑制剂研究胰敏素的作用机制：利用qPCR检测糖异生相关基因SIRT1、PPARγ、PGC-1α和PGC-1β的mRNA表达，利用Western blot检测PI3K、Akt、GSK3β的激活状态。 结果：(1)成功构建肝细胞的胰岛素抵抗模型。(2)胰敏素处理胰岛素抵抗的肝细胞后能够显著增加糖原含量，减少G6P和PEPCK的含量，增加SIRT1和PPARγ的mRNA表达，降低PGC-1α的mRNA表达，降低IRS-1的丝氨酸磷酸化水平，增加Akt和ERK的磷酸化激活。(3) PI3K特异性抑制剂预处理胰岛素抵抗的肝细胞能够阻断胰敏素对胰岛素通路的激活，并消除胰敏素对糖异生相关调控基因的影响。 小结：(1)胰敏素通过影响肝细胞糖异生相关基因的表达抑制糖异生。 (2)胰敏素通过抑制IRS-1的丝氨酸磷酸化，激活Akt/ERK磷酸化改善胰岛素抵抗。 第3章胰敏素对高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗的改善作用 目的：观察胰敏素对高脂饮食诱导小鼠对胰岛素抵抗的改善作用。 方法：(1)采用高脂饮食喂养小鼠，构建胰岛素抵抗小鼠模型。(2)利用HE染色及透射电镜观察肝脏组织结构变化，利用ELISA检测肝脏糖原、G6P和PEPCK的含量与血液中胰岛素、甘油三脂、游离脂肪酸和胆固醇的含量，利用qPCR检测肝脏组织、肌肉组织及脂肪组织中糖异生相关基因SIRT1、PPARγ、PGC-1α、PGC-1β、FOXO1和G6P的mRNA表达，利用Westem blot检测IRS-1、Akt、ERK、JNK及其磷酸化水平。 结果：(1)成功构建高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠模型。 (2)胰敏素处理胰岛素抵抗小鼠后能够显著减少血液中甘油三脂、胆固醇和脂肪酸的含量，但是不减少胰岛素的含量；增加肝脏糖原，减少G6P和PEPCK的含量，增加SIRT1和PPARγ的mRNA表达，降低PGC-1α、PEPCK、G6P和FOXO1的mRNA表达，降低IRS-1的丝氨酸磷酸化水平，增加磷酸化Akt和ERK的表达。 小结：(1)胰敏素可使高脂饮食小鼠肝脏、肌肉和脂肪组织中的糖异生减少及糖原生成增加。(2)胰敏素通过抑制高脂饮食小鼠肝脏、肌肉和脂肪组织中IRS-1的丝氨酸磷酸化，激活Akt/ERK磷酸化改善胰岛素抵抗。 结论：成功构建的全新纯人源性重组蛋白INSR-IgG4Fc（即胰敏素），并证实其通过抑制IRS-1丝氨酸磷酸化，促进Akt／ERK磷酸化改善肝细胞及小鼠肝脏组织、肌肉组织、脂肪组织的胰岛素抵抗。
胰岛素抵抗;胰敏素;2型糖尿病;重组蛋白;改善作用
南华大学
博士
基础医学
廖端芳
2015
中文
R587.1
2019-01-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）