中华鲟主要组织相容性复合物II(MHC Ⅱ)cDNA克隆及功能研究
中华鲟（Acipenser sinensis）是一种古老而又珍贵的软骨硬鳞鱼类，因其对生物进化过程有着极为重要的研究意义，被称为“水中活化石”。目前中华鲟的研究主要集中在人工养殖方面，而中华鲟免疫学方面的研究较少。主要组织相容性复合物Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ，MHC Ⅱ）类分子通过向CD4+ T淋巴细胞提呈抗原性多肽，从而在适应性免疫应答中发挥重要作用。MHC Ⅱ是由α和β两种亚基组装成的异源二聚体，在Ii chain（MHC Ⅱ-association invariant chain，又称MHC Ⅱγ）的协助下，进行正确组装和高效的转运。本文以中华鲟为研究材料，围绕中华鲟MHC Ⅱ基因的cDNA克隆和免疫活性功能开展以下研究： 1. 提取中华鲟脾脏总RNA，通过RT-PCR构建cDNA文库，高通量测序筛选得到CsMHC Ⅱα，CsMHC Ⅱβ和CsMHC Ⅱγ的cDNA序列。结果分析，CsMHC Ⅱα，CsMHC Ⅱβ和CsMHC ⅡγcDNA序列分别包含726bp、798 bp和879 bp的开放阅读框。氨基酸序列对比结果发现，CsMHC Ⅱα/β几乎包含已知其他物种MHC Ⅱα/β序列的全部结构特征：一个前导肽、α1/α2和β1/β2结构域、CP/TM/CYT区域和保守的半胱氨酸残基。与其他鱼类 MHC Ⅱα相似的是，在CsMHC Ⅱα中与的α1结构域包括一个潜在的糖基化位点（36NGT38），但其他鱼类的糖基化位点通常在α2结构域。哺乳类和两栖类的MHC Ⅱα通常包含两个潜在的糖基化位点。CsMHC Ⅱγ包含一个Ig-MHC样区、Ⅱ类相关Ii链肽（CLIP）、甲状腺球蛋白Ⅰ型重复区和三个保守的二硫键，同时还具有两个潜在的糖基化位点（152NET154 和167NSS169）。 2.利用qRT-PCR检测CsMHC Ⅱα，β，γ在中华鲟组织中的表达。结果显示，CsMHC Ⅱα和β链在脾脏中表达量最高，而CsMHC Ⅱγ链在头肾中表达量最高。利用 poly（I∶C）或灭活三联鳗弧菌疫苗刺激中华鲟MHC Ⅱα和β的mRNAs的表达会上调，并且它们的转录水平在整体上poly（I∶C）刺激的比细菌疫苗诱导上调地更快。然而，在脾脏和肠中利用poly（I∶C）刺激后CsMHC Ⅱγ的表达水平比细菌疫苗诱导后的更高，而在头肾和肝脏中则低于细菌疫苗诱导。 3.构建pCMV-His-CsMHC Ⅱα，pCMV-HA-CsMHC Ⅱβ、pCMV-Flag-CsMHC Ⅱγ以及pCMV-Flag-mutCsMHC Ⅱγ（Ser29/Ser34→Ala29/ Ala34）表达质粒，当在小鼠树突细胞中共表达CsMHC Ⅱα，β，γ时，CsMHC Ⅱγ链分别与CsMHC Ⅱ α和β链存在相互作用。此外，在小鼠树突状细胞中过表达的CsMHC Ⅱγ链显著激活NF-κB和STAT3转录因子，并诱导TNF-α和IL-6的表达。当CsMHC Ⅱγ中Ser29/ Ser34突变为Ala29/ Ala34，CsMHC Ⅱγ的上述活性几乎消失了。 本课题研究揭示中华鲟MHC Ⅱα，β，γ链在中华鲟病原微生物感染的免疫应答中发挥重要作用，且有可能通过在脊椎动物进化过程中保守的功能机制发挥作用。本研究将有助于了解中华鲟的免疫生物学，为中华鲟繁殖和保护过程中的疾病防治提供理论和实验指导。
中华鲟;主要组织相容性复合物Ⅱ;cDNA克隆;免疫应答;NF-κB通路;STAT3蛋白
温州大学
硕士
化学生物学
廖志勇
2018
中文
S917.4
2019-01-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）