高葡萄糖对人内皮细胞Siglec-9糖蛋白配体表达的影响及机制的研究
唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素（ Sialic-acid-binding Immunoglobulin-like Lectin；Siglec）是表达在免疫细胞上的与唾液酸聚糖结构特异性结合的非分泌型免疫球蛋白样凝集素亚家族，其中Siglec-9（人源性）和Siglec-E（小鼠源性）为不同种属间结构相似而功能相同的直系同源物。Siglec-9在人体的中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和自然杀伤细胞上特异性表达，受组织上表达的特定糖链配体激活，从而发挥缓解炎症反应的作用。 动脉粥样硬化等血管性病变的发生与局部炎症密切相关，而这些炎症反应大多是由炎性细胞所介导，提示对血管局部炎性细胞的活性进行调控有可能成为防治炎症性血管疾病的新措施。目前对Siglec-9结构功能的研究相对已经比较全面与深入，然而对Siglec-9配体尚起步不久，尤其是对于人血管组织Siglec-9配体的研究尚未见报道。鉴于Siglec-9在中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和自然杀伤细胞等炎症免疫细胞上广泛表达，而泡沫细胞形成是动脉粥样硬化发生的初始步骤，巨噬细胞源性泡沫细胞则是最早出现的泡沫细胞。因此，本研究希望通过对人血管Siglec-9配体的研究、寻找通过激活Siglec-9达到减缓血管炎症、从而防治动脉粥样硬化等炎症性血管疾病的新途径。 为此，本课题拟对人主动脉及人内皮细胞（HUVEC）上的Siglec-9配体进行表征，并探索动脉粥样硬化重要危险因素高葡萄糖对人内皮细胞（HUVEC）Siglec-9配体表达的影响及其初步分子机制，旨在为深化对Siglec-9配体在血管局部炎症调节中作用的认识提供实验依据。 方法： 1. 为了证实Siglec-9配体在人内皮细胞（HUVEC）上的分布，我们通过免疫组化分析将正常人类主动脉的切片用Siglec-9-Fc染色，同时通过免疫荧光对HUVEC进行分析。 2. 为了证明人 Siglec-9 配体的连接方式，通过 Western blot 检测对主动脉和HUVEC样本进行唾液酸处理发现Siglec-9靶向连接的方式；为了确定Siglec-9配体糖的生物合成，对HUVEC给予Benzyl-α-GalNAc，Swainsonine，Tunicamycin三种不同的糖基化抑制剂；为了进一步确定Siglec-9配体糖的生物合成，对HUVEC进行Western blot检测过程中给予强碱，酸和PNGase F处理。 3. 为了研究Siglec-9配体的调节是否是动脉粥样硬化的危险因素，我们给予空白，葡萄糖（8g/L），ox-LDL（100mg/L），LPS（100μg/L），甘露糖（8g/L）。发现HUVEC在给予葡萄糖后Siglec-9配体明显增加，然后随即做了HUVEC在给予葡萄糖不同时间，不同剂量下Western blot检测。同时还在小鼠体内对Siglec-9的同源物Siglec-E进行了高糖实验。 4. 由于GALE调节UDP-葡萄糖/UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖胺/UDP-半乳糖胺的平衡，是Leloir途径中半乳糖代谢的一个关键酶。为了证明Siglec-9配体的表达是否通过GALE调节，通过Western blot检测发现高糖组GALE明显降低。因此我们通过HUVEC在有/无高糖刺激下siRNA，CRISPR激活质粒，TPCK对GALE的作用进行分析初步发现Siglec-9配体的表达的机制。在高糖刺激下，观察CRISPR激活/抑制质粒对Siglec-9配体和GALE的表达的影响。 5. 为了探索GALE表达变化的机制，利用PCR技术探讨高糖，LPS，ox-LDL GALE的mRNA水平，同时在这些处理条件下对GALE DNA甲基化水平进行检测。另外对HUVEC在高糖作用下给予地西他滨（DNA甲基化抑制剂），Thiamet G(UDP-GlcNAc抑制剂)，TPCK（NF-κB抑制剂），探索高糖是否逆转GALE和Siglec-9配体的改变。并对相关miRNA表达水平进行了检测。 6. 通过HUVEC与巨噬细胞共培养后应用流式细胞术检测巨噬细胞凋亡和吞噬功能来探讨高糖诱导的Siglec-9配体表达变化可能的生物学作用。 结果： 1. Siglec-9配体在人主动脉和人内皮细胞（HUVEC）广泛表达，主要分布在血管组织内膜和中层。 2. Siglec-9配体都＞70kDa，靶向连接都是通过唾液酸糖蛋白配体连接。Siglec-9配体主要是O-连接的唾液酸糖蛋白。 3. 在高糖作用下人Siglec-9配体均大幅上调，小鼠主动脉Siglec-E（与人Siglec-9相对应）配体也明显上调。 4. 对人内皮细胞（HUVEC）的Siglec-9配体变化的控制，是通过改变GALE和增加细胞的半乳糖胺来完成的。 5. 在高糖作用下GALE mRNA水平发生显著变化，其机制与与DNA甲基化水平、O-GlcNAc修饰水平及NF-κB通路无关，而与miRNA hsa-let-7f水平改变相关。 6. 在高糖条件下与人内皮细胞（HUVEC）共培养的人类巨噬细胞的活性发生变化。随着Siglec-9配体表达的增加巨噬细胞凋亡增加，吞噬能力下降。 结论： 1. 在人主动脉和人内皮细胞（HUVEC）中存在Siglec-9配体的表达；其配体主要是通过O-连接的唾液酸糖蛋白。 2. 高葡萄糖可导致人内皮细胞（HUVEC）中Siglec-9唾液酸糖蛋白配体上调，其机制与GALE表达降低从而影响GalNAc浓度有关。 3. 人内皮细胞（HUVEC）中Siglec-9配体表达的增加，能够导致共培养的巨噬细胞吞噬能力降低与凋亡增加。
Siglec-9配体;人内皮细胞;高葡萄糖;动脉粥样硬化;动物实验
陆军军医大学
硕士
药学(药理学)
李晓辉
2018
中文
R967;R543.5
2019-01-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）