二氧化硅纳米颗粒的神经发育和角膜毒理机制及防治研究
研究背景： 二氧化硅纳米颗粒（Silicon dioxide nanoparticles, SiO2NPs）是一种广泛应用的无机纳米材料，在医学和生物领域有着巨大应用前景。研究显示，SiO2 NPs可以作为向细胞内传递基因的非病毒载体。例如，SiO2 NPs作为蛋白质载体导入细胞后可调控细胞功能，也可用于体内标记和追踪神经干细胞（Neural stem cells, NSCs）。由于SiO2NPs可以透过血脑屏障，使得中枢神经系统成为SiO2 NPs的潜在暴露靶区。婴幼儿阶段是神经发育的关键阶段，纳米材料对神经系统的毒性作用可导致大脑发育异常。然而， SiO2 NPs对中枢神经系统的潜在威胁一直被人们所忽视。神经干细胞的增殖和分化部分模拟了神经发育的重要环节，以神经干细胞为离体模型研究SiO2 NPs的神经毒性及作用机制，对于阐明SiO2 NPs对神经发育的影响具有重要意义。 除了医学和生物学应用，纳米颗粒也是空气污染颗粒物的主要成分。眼睛直接暴露于污染空气中的颗粒物。其中角膜位于眼表的前部，并作为眼睛抵御外界物质的屏障。干眼病是临床常见的眼科疾病，空气污染所致的角膜损伤和泪膜不稳定与干眼病密切相关。近期研究发现粗PM和粉尘暴露对角膜具有毒性。然而，关于超微PM对角膜的毒性，PM粒径对角膜毒性的影响以及对抗该毒性的治疗方法尚不清楚。 研究方法： 对于神经发育研究，合成SiO2NPs，按0、100、200和400μg mL?1的浓度处理小鼠C17.2 NSCs。通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术，检测不同浓度条件下C17.2 NSCs吞噬SiO2 NPs与细胞功能的关系。通过相差显微镜观察NSCs的形态，采用流式细胞术检测C17.2 NSCs暴露于不同剂量的SiO2 NPs后细胞死亡和凋亡水平；通过Ki67染色和流式细胞术检测细胞周期，分析SiO2 NPs暴露后NSCs增殖水平的改变。透射电镜分析不同剂量SiO2NPs处理后，C17.2 NSCs亚细胞结构，尤其是线粒体结构的变化。RNA-Seq检测C17.2 NSCs暴露于FITC-SiO2 NPs后的基因表达谱变化，筛选差异基因和相关信号通路，并寻找暴露后的靶点基因。 对于角膜损伤和防护研究，合成不同粒径的SiO2 NPs，培养人原代角膜上皮细胞（humancorneal epithelial cells, hCECs）并进行鉴定，作为离体模型。先在0-200μgmL-1浓度范围比较不同粒径SiO2 NPs对hCECs细胞活性的影响。采用相差显微镜和台盼蓝染色检测不同粒径SiO2 NPs引起hCECs细胞死亡水平的差异。透射电镜检测hCECs暴露于不同粒径SiO2 NPs后超微结构的改变。采用二氢乙啶(Dihydroethidium, DHE)和四甲基罗丹明乙酯（Tetramethylrhodamine ethyl ester,TMRE）分别检测hCECs在不同粒径SiO2 NPs处理下超氧化物阴离子和线粒体膜电位水平的变化，探讨造成损伤的机制。选用谷胱甘肽、白藜芦醇、姜黄素和胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS），检测能否减弱超微SiO2 NPs对hCECs造成的损伤。选用大鼠连续5天角膜暴露作为在体实验模型，通过角膜荧光素钠染色、前节OCT和扫描电镜验证超微SiO2 NPs和细微SiO2 NPs对角膜的毒性差异，以及FBS对角膜损伤的修复效果。 研究结果： 1、二氧化硅纳米颗粒对神经干细胞的毒性作用及机制研究 神经干细胞在神经发育过程中起着重要作用。神经干细胞的增殖、凋亡等模拟了神经发育的过程，可以作为神经发育的细胞模型。本章着重研究SiO2 NPs对NSCs的毒理学效应，尤其是对NSCs增殖、凋亡等命运的影响及分子机制。 （1）共聚焦激光显微镜检测发现，C17.2神经干细胞暴露于FITC-SiO2 NPs 48小时后对SiO2 NPs的吞噬量呈剂量依赖性。流式细胞术检测显示用 0、100、200 和400μg mL?1的FITC-SiO2NPs处理C17.2 NSCs后，细胞内FITC荧光逐渐增强，证实其吞噬程度与暴露剂量相关； （2）相差显微镜下检测发现，暴露于200和400μg mL?1SiO2NPs后，C17.2NSCs细胞密度降低。流式细胞术检测发现，200和400μg mL?1的SiO2NPs处理后，NSCs的凋亡水平显著升高，而100μg mL?1组与对照组之间NSCs的凋亡水平无显著差异。提示200μg mL?1及以上浓度的SiO2NPs处理会诱导NSCs凋亡； （3）Ki67免疫荧光染色发现，暴露于200和400μg mL?1SiO2NPs后，C17.2NSCs细胞中Ki67阳性细胞率降低。流式细胞术检测细胞周期发现，200和400μg mL?1的SiO2NPs处理后，NSCs的增殖指数显著降低，而100μg mL?1组与对照组之间NSCs的增殖指数无显著性差异。提示200μg mL?1及以上浓度的SiO2NPs会显著抑制NSCs增殖； （4）透射电镜检测发现，200μg mL?1SiO2NPs处理后，NSCs的线粒体出现明显肿胀，线粒体嵴被破坏或缺失。400μg mL?1SiO2NPs处理后，NSCs的细胞膜被完全破坏，形成空泡化的细胞质和细胞器。而100μg mL?1SiO2NPs处理后，NSCs的线粒体结构良好，无明显肿胀、断裂等异常。提示200μg mL?1及以上浓度的SiO2NPs会导致NSCs线粒体损伤和细胞坏死； （5）RNA-Seq分析发现，C17.2 NSCs暴露于SiO2 NPs后的基因表达谱出现显著变化。对 RNA-Seq筛选出的差异表达基因并进行 KEGG通路分析发现：三条相关通路参与SiO2 NPs对NSCs的毒性作用，这三条通路分别是：外源性物质代谢相关的细胞色素P450通路、药物代谢相关的细胞色素P450通路和谷胱甘肽代谢通路。共表达网络分析提示：SiO2 NPs 作用于 NSCs 的靶向基因为 GSTM1，GSTM7 和 GSTT1。RT-qPCR进一步验证，发现SiO2 NPs处理后，这三个靶向基因表达显著降低。提示GSTM1，GSTM7和GSTT1三个基因是SiO2 NPs 损伤NSCs的靶点。 2、不同粒径二氧化硅纳米颗粒对角膜的毒理学评估及修复方式研究 大气污染中颗粒物质对眼表的危害日益受到人们关注。空气中的纳米尺寸的颗粒的会引起眼表急性反应，包括眼部不适、灼伤和发红。然而，颗粒物粒径与角膜损伤之间的关系尚不清楚，本章应用不同粒径的SiO2 NPs，探索纳米颗粒粒径对角膜毒性的影响，并探究其修复方式。 （1）CCK8检测人角膜上皮细胞暴露于不同剂量和粒径SiO2 NPs后细胞活性。选用超微SiO2NPs（30和40 nm）和细微SiO2NPs（100和150nm）分别模拟PM0.1和PM2.5的尺寸。研究发现：在100 μg mL-1和200 μg mL-1的浓度下，超微SiO2 NPs处理后的hCECs细胞活性显著降低，而细微SiO2 NPs处理后没有发现这种细胞毒性。提示SiO2 NPs粒径是影响其细胞毒性的关键因素； （2）采用相差倒置显微镜检测细胞形态，发现在100μg mL-1的浓度下，当hCECs暴露于超微SiO2 NPs后细胞崩解，而暴露于细微SiO2 NPs后无明显损伤。台盼蓝染色证实，与对照组相比，hCECs暴露于超微SiO2 NPs而不是细微SiO2 NPs后，活细胞比例显著降低。证实超微SiO2 NPs对hCECs细胞产生显著细胞毒性； （3）透射电镜检测发现，对照组线粒体正常，具有双膜结构和形态良好的线粒体嵴，暴露于细微SiO2 NPs后，hCECs线粒体结构正常，没有明显的线粒体肿胀或嵴的断裂。而暴露于超微SiO2 NPs后，只能看到hCECs细胞碎片，而不能观察到正常的线粒体结构。提示超微SiO2 NPs进入细胞后主要损伤线粒体； （4）通过DHE和TMRE分别检测hCECs暴露于不同粒径SiO2 NPs后超氧化物阴离子和线粒体膜电位水平损。发现在暴露于超微 SiO2 NPs 后早期，hCECs 的 O2??水平显著增加。而在暴露于超微SiO2 NPs后1h至24h，hCECs的TMRE荧光水平均显著降低，提示SiO2 NPs暴露可导致hCECs线粒体膜电位的降低和线粒体的功能障碍； （5）hCECs暴露于SiO2 NPs损伤后修复方式筛选。发现抗氧化作用的化合物——谷胱甘肽、白藜芦醇和姜黄素，均不能降低超微SiO2 NPs对hCECs的毒性。而1%到100%浓度的FBS均能显著改善暴露于超微SiO2 NPs的hCECs的细胞活性，并阻止线粒体肿胀和保护线粒体功能。提示通过蛋白冠修饰纳米颗粒而非抗氧化应激是阻断SiO2 NPs细胞毒性的有效措施； （6）不同粒径SiO2 NPs对大鼠角膜的影响及FBS修复效果验证。与离体实验结果一致，暴露于超微SiO2 NPs而不是细微SiO2 NPs的大鼠眼表会出现明显的角膜损伤，而暴露期间应用FBS可以减弱超微SiO2 NPs对大鼠角膜的损伤程度。 研究结论： 研究结果提示：当神经干细胞暴露于200μg mL?1或更高浓度的SiO2NPs后，其增殖水平降低而细胞死亡增加，GSTM1，GSTM7和GSTT1是SiO2 NPs引起NSCs损伤的主要靶基因。超微SiO2 NPs（30nm和40nm）比细微SiO2（100nm和150nm） NPs对角膜具有更严重的毒性作用，可引起角膜上皮细胞线粒体损伤和线粒体膜电位降低，而在眼表滴加FBS或衍生物可以减弱超微SiO2 NPs对角膜的损伤。本研究评估了SiO2 NPs 对神经干细胞和角膜的毒性效应，探究其损伤机制和靶点，并筛选防治方法，分别为SiO2 NPs的医学应用和作为环境暴露物提供了安全性评估和有效预防方案。
二氧化硅纳米颗粒;神经干细胞;角膜毒性;损伤机制;动物实验
陆军军医大学
硕士
生理学
徐海伟
2018
中文
R992
2019-01-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）