长链非编码RNA TUG1吸附miR-29c促进慢性缺氧时心肌纤维化机制的研究
研究背景： 器官纤维化及其进一步引起的器官衰竭造成了世界上多种疾病的病死率居高不下。有报道称发展中国家 50%的疾病死亡率都是由器官纤维化引起的[1]。而在心脏，不仅仅是心肌梗死、糖尿病、高血压以及慢性肾脏疾病引起的心力衰竭等几乎所有心脏疾病都最终可导致心肌纤维化。慢性心衰是引起全世界成年人死亡率最高的原因[2]。心脏纤维化可分为两种类型：反应性纤维化和修补性（替代性）纤维化。反应性纤维化，特征就是 ECM 成分在心肌间质或是血管周围的过分沉积。反应性纤维化被认为是一种心脏为了增加室壁韧性和保持心输出量的适应性反应。但是间质过分的纤维化可能会引起心脏弹性减弱，导致心脏舒张功能障碍以及破坏心肌细胞电传导而导致心脏舒缩功能失调。此外过分的管周纤维化会减低氧气及营养物质向组织的输送而导致心肌的能量不足。因此反应性纤维化与心脏的生理及病理环境关系密切[3, 4]。而替代性纤维化，通常是发生了大量的心肌细胞丢失而替代产生并且形成瘢痕，以维持心脏结构地完整性。ECM沉积既是慢性心衰疾病病理生理过程中一个重要的组成部分同时也是一个十分有前景的治疗靶点[5]。因此，对心肌纤维化机制的研究探索的热潮在心血管领域从未减温。 ECM成分的产生与降解的平衡主要由心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）进行调节。而在一些心脏疾病的发生发展的过程中，结缔组织中的CFs通常转化为其活化形式，通常认为是肌成纤维细胞（myofibroblasts），而后者分泌功能增加并且具有一定的收缩能力，形成一个促纤维化的微环境。局部的纤维反应如果控制不良，心脏的纤维化过程呈进行发展，引起心肌肥厚、心室扩张、心肌凋亡并最终发展为不可逆的充血性心力衰竭[6-8]。多种物理及生理生化因素都可激活多种信号通路来促进CFs的活化，着其中包含了一系列复杂又精密的生长因子/细胞因子及神经内分泌因子的相互作用网络，如血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ）、内皮素-1（endothelin-1，ET-1），转化生子因子-β（transforming growth factor-β）、血小板来源生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等。通过抑制、调节成纤维细胞的活化来调控甚至逆转心肌纤维化的进程也越来越多的受到关注[9]。 不仅逐渐发展的心肌纤维化会影响心肌细胞对氧气和营养物质的摄取，这是一个互相影响的恶性循环的过程，氧气和营养物质的缺乏也会作为刺激因素进一步加速、加重纤维化的进程。器官缺血缺氧所致的纤维化已多有报道，慢性肾衰时的肾脏纤维化，脂肪肝时的肝脏纤维化以及心肌梗死时的心肌纤维化都有缺血缺氧与纤维化两者相互作用参与，而最终致器官功能衰竭[10]。组织缺血一般都连带包含了组织缺氧，而且目前多数的研究更多地集中在组织缺血缺氧所致的纤维化过程。随着研究的深入，目前研究者对组织缺氧有了更加深刻的认识。除了已有研究对慢性缺氧适应带来的心肌抗损伤能力增强的报道之外，有研究提出慢性适度缺氧可促进心肌再生[11]。然而，慢性缺氧而引起的一系列缺氧相关的转录因子的过度激活及蓄积，如 HIF，也会对心肌细胞内的钙稳态等一系列生理过程产生影响，进而影响心肌功能[12]。因此，如何利用好慢性缺氧这把双刃剑，需要我们在研究慢性缺氧对心肌耐受能力及再生能力提高的同时，更要深入研究慢性缺氧对心肌可能会带来的损伤，从而扬长避短地发挥慢性缺氧的作用。其中缺氧对组织纤维化的影响，对成纤维细胞的活化作用的研究就显得十分的必要。 随着高通量测序技术的不断精进，越来越多的非编码RNA（noncoding RNAs， ncRNAs）被发现在心脏的发育过程以及病理生理过程中发挥着重要作用。这些ncRNAs包括了大家所熟知的微小 RNAs （ microRNAs ， miRs ）、长链非编码 RNAs （ Long noncoding RNAs，LncRNAs）、循环RNAs（circulating RNAs，circRNAs）等。miRNAs在心血管领域中的重要作用已经得到公认。其中 miR-29 家族其三个成员 miR-29a， miR-29b以及miR-29c均与心肌纤维化有着密切关系。miR-29家族可以调控ECM的众多成分，包括多种胶原、MMPs、弹性蛋白及纤连蛋白等，并且还可以通过抑制TGF-β/Smad3 信号通路发挥其显著的抗纤维化作用[13]。而 lncRNAs 的发现及研究较miRNAs 晚，但其在生理发育以及疾病发展的过程中的同样发挥着重要的作用，目前尤其受到大家的关注。如缺氧相关的一些lncRNAs如NEAT1，TUG1，心脏病理生理过程中重要的lncRNAs如Fendrr，HOTAIR等。虽然对于lncRNAs领域还处于初级阶段，但已有研究提出小鼠心脏内的一些lncRNAs，有希望治疗心肌梗死或压力超负荷导致的心肌肥厚[14]；最近还有报道提出lncRNAs与miRNAs也存在精密复杂的作用网，可通过相互作用在多器官的病理生理过程中发挥重要作用[15]，说明lncRNAs用于治疗的前景还是十分光明的。因此，是否同样有lncRNAs在缺氧纤维化的过程中发挥着重要作用，甚至可能成为临床上早期诊断或是治疗的心脏疾病的新靶点。 研究目的和内容： 本课题拟通过对慢性缺氧对心肌纤维化的影响以及 LncRNAs 在其中的作用进行研究，为慢性缺氧影响心脏病理生理过程的进一步研究，为临床干预心肌纤维化以及避免缺氧损伤提供新的思路及策略。 研究方法 1. 选取临床上在我科行外科手术治疗的先心病患者剪除的右室流出道心肌组织。根据患者入院时的经皮血氧饱和度（SpO2）进行分组，SpO2<85%的患者归为紫绀组， SpO2≥95%的归为非紫绀组，85%≤SpO2<95%的患者归为中间组，共19例。将取得组织分别保存于4%多聚甲醛及液氮中，用于后续实验。 2. 10%的氧浓度对8周龄的成年小鼠进行缺氧饲养4周，为缺氧组。同期将同样数量的小鼠在正常大气压下进行常规饲养4周，为常氧组。四周后，同时取出小鼠的心脏并称重，测量相应小鼠的胫骨长度。取出心肌组织分别保存于 4%多聚甲醛及液氮中，用于后续实验。 3. 取8周龄的成年小鼠心脏，酶解法消化心肌组织，分离原代心脏成纤维细胞，常氧及缺氧培养。分别选取0h，6h，12h及24h时间点，CCK-8试剂盒检测细胞增殖水平，免疫荧光直观检测细胞内肌丝的表达情况，并提取常氧及缺氧情况下各个时间点的细胞RNA、蛋白质，储存并用于后续实验。 4. TUG1特异性的shRNA或是miR-29c的类似物mimic转染入原代成纤维细胞，分别CCK-8检测细胞增殖水平，提取细胞的RNA及蛋白质，用于后续检测在缺氧和常氧的情况下，TUG1受抑制以及miR-29c过表达对成纤维细胞活化水平的影响。 5. 含有预测TUG1与miR-29c靶结合位点（野生型/突变型）的双荧光素酶报告基因质粒与miR-29c的特异性mimic通转染如293T细胞，并用酶标仪来检测荧光素酶的相对活性来验证结合位点。 6. 4%多聚甲醛固定的组织，用于进一步制成石蜡切片，并用Masson染色，倒置显微镜采集图片，来检测组织纤维化程度。储存于液氮中的组织，一部分用包埋及处理后制成冰冻切片，利用免疫荧光标记成纤维细胞及肌成纤维细胞并计数，激光共聚焦采集荧光图片，来检测肌成纤维细胞的比例。 7.利用Western Blot的方法来检测组织及细胞蛋白中COLI及α-SMA的相对表达情况，利用RT-qPCR的方法来检测组织及细胞RNA中TUG1及miR-29c的相对表达情况。 研究结果： 1. 相较于非紫绀组患者心肌组织标本，紫绀组患者心肌组织Masson染色结果显示的胶原比例增多（p＜0.05），组织免疫荧光染色显示肌成纤维细胞细胞的比例更多（p＜0.05）。在纳入中间组一起统计后，胶原比例及肌成纤维细胞比例均与患者血氧饱和度呈反比。并且TUG1在紫绀组先心病心肌组织标本中表达较高（p＜0.05）。 2. 慢性缺氧小鼠模型的心肌组织标本检测中，缺氧组与常氧组小鼠相比，心脏体重质量比以及心脏质量胫骨长度质量比均较高（p＜0.05），说明慢性缺氧心脏质量增加。心肌组织Masson染色显示缺氧组胶原比例增高（p＜0.05），组织免疫荧光染色显示缺氧组肌成纤维细胞比例增高（p＜0.05），且TUG1在缺氧小鼠心肌组织中表达增高（p＜0.05）。 3. 离体培养成年小鼠原代心脏成纤维细胞进行缺氧刺激。随缺氧时间的延长，成纤维细胞内的肌丝表达增加，COLI 表达增加，增殖水平增加，且其 TUG1 的表达水平增加，表明缺氧促进心脏成纤维细胞活化为肌成纤维细胞细胞。 4. 生物信息学网站预测TUG1与miR-29c存在结合位点，且双荧光素酶报告基因的结果证实了预测的TUG1与miR-29c的结合位点。且在临床组织、慢性缺氧小鼠心肌组织以及离体培养的成纤维细胞缺氧处理后检测的miR-29c的表达水平与TUG1呈负相关。 5. 成年小鼠原代心脏成纤维细胞TUG1表达受抑制后，即使仍在缺氧刺激下，成纤维细胞增殖水平降低，成纤维细胞内肌丝表达减少，COLI 表达降低，肌成纤维细胞活化水平降低，抑制TUG1从而抑制了缺氧促进的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。 6. 成年小鼠原代心脏成纤维细胞TUG1表达抑制后发现细胞内的miR-29c表达较空白组和阴性对照组表达有所增高，甚至在缺氧的情况下miR-29c降低的情况有所缓解。 7. 成年小鼠原代心脏成纤维细胞过表达miR-29c后，成纤维细胞增殖水平，细胞内肌丝表达的水平以及 COLI 的水平都有所降低，成纤维细胞活化为肌成纤维细胞的效率降低，即使在缺氧的情况下，这种活化亦可被过表达miR-29c产生一定程度的缓解。 结论： 1. 紫绀型先心病患者心肌组织纤维化程度、成纤维细胞活化程度以及TUG1的表达水平均高于非紫绀型先心病患者，说明慢性缺氧使人心肌组织纤维化水平增高，而TUG1可能参与此过程。 2. 慢性缺氧小鼠心肌组织纤维化程度、成纤维细胞活化程度以及TUG1的表达水平高于常氧环境饲养小鼠，且离体实验中证实了缺氧可促进成年小鼠原代心脏成纤维细胞活化，并且TUG1的表达也随缺氧时间的延长而增加。TUG1可能参与慢性缺氧小鼠心肌组织纤维化及离体成纤维细胞缺氧刺激后活化为肌成纤维细胞的过程。 3. 抑制小鼠原代心脏成纤维细胞中 TUG1的表达，可降低 TUG1 对 miR-29c 的吸附作用，减轻了miR-29c的受抑制程度，使得miR-29c的抗纤维化作用得以发挥，从而抑制成纤维细胞的增殖水平、COLI及α-SMA表达水平，即减少成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，进而减轻纤维化的程度。
心肌纤维化;长链非编码RNA;内皮素-1;miR-29c;慢性缺氧
陆军军医大学
博士
外科学(胸心外)
肖颖彬
2018
中文
R542.23
2019-01-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）