小分子药物通过调控能量代谢及免疫反应促进心肌梗死再生修复研究
目前我国的心脑血管疾病的发病率及死亡率已超过癌症成为首位,并且其发病人群逐渐年轻化,给社会及患者家庭带来了沉重的负担.目前,我国平均每5个成年人中就有一个人患心脑血管疾病,全国约有 3 亿患者,死亡率大约在 30%左右.其中,急性心肌梗死是心脑血管疾病中主要疾病,且易发生于目前生活压力巨大的年轻人中,数据显示,我国每年约新发60万例急性心肌梗死,其中因救治不当或二次梗死导致的死亡人数约为20万,而发病率及死亡率逐年升高.因此,对于急性心肌梗死的救治刻不容缓. 急性心肌梗死发生后,因为缺血继发的细胞死亡有内部原因和外部原因,内部原因包括细胞代谢紊乱导致细失活,以及线粒体大量分裂失去能量供给;外部原因则主要为细胞碎片诱发固有免疫反应,促进梗死区域炎性细胞不断聚集并分泌炎性细胞因子,恶化梗死区域微环境,进一步导致更多的细胞死亡,死亡的细胞再次促进炎性因子的分泌,引发级联反应,最终扩大梗死面积,导致心功能失常.针对急性心肌梗死中导致细胞死亡的不同原因,寻找相应的关键靶点分子,并对关键分子进行特异性干预,对急性心肌梗死的恢复具有潜在意义. 在急性心肌梗死中,细胞代谢紊乱是导致细胞死亡的原因之一.在细胞代谢过程中,Sirtuin家族作为一类组蛋白去乙酰化酶,可通过其去乙酰化作用参与细胞代谢的相关进程.Sirt3是Sirtuin家族中的一个亚型,位于线粒体中,参与线粒体能量供给的相关代谢进程.Sirt3的激活可有效保护细胞处于低能量状态,维持细胞存活.急性心肌梗死中,梗死区域的细胞处于低能量状态,因此,Sirt3有可能在维持梗死区域的细胞存活中发挥重要作用.Sirt3 有可能作为治疗急性心肌梗死的重要靶点,以 Sirt3 为靶点筛选特异性小分子化合物有可能为急性心肌梗死的治疗提供重要的候选药物. 梗死区域中细胞死亡的原因之一是线粒体大量分裂,供能发生障碍,失去能量供给.在正常细胞代谢中,线粒体处于分裂与融合的动态平衡中,维持一定数量.当细胞外部能量供给缺乏时,胞内线粒体在线粒体分裂蛋白OMA1的作用下将线粒体分裂成小碎片,导致细胞失去胞内能量供应,从而加速细胞死亡.因此,为了维持细胞胞内能量供给,通过抑制OMA1的表达进而抑制线粒体分裂,保护细胞存活,有可能是治疗急性心肌梗死的另一种候选方案,而筛选验证OMA1的特异性抑制剂有可能作为急性心肌梗死临床治疗的潜在药物. 急性心肌梗死中,大量的细胞破裂死亡,破裂的细胞碎片可激活梗死区域的固有免疫反应.免疫细胞大量聚集在梗死区域,NLRP3炎性小体被激活,聚集的免疫细胞不断释放各种炎性因子并累积在梗死区域,改变梗死区域的微环境使得不再适宜细胞生存,从而导致更多的细胞死亡,而死亡的细胞又再次促进炎性因子分泌,诱发级联反应,不断扩大梗死面积,导致心功能失常.因此,有效抑制 NLRP3 炎性小体的活性,降低炎性因子的分泌,改善梗死区域的微环境,维持细胞生存,有可能是治疗急性心肌梗死的重要靶点;同时,筛选 NLRP3 炎性小体的抑制剂有可能作为急性心肌梗死治疗的候选药物. 目前的给药途径多为口服或静脉注射,这两种给药方式不但会导致药物随机分布于机体全身,而且会使真正聚集在目标组织或细胞中的药量很少.这两种给药方式不但降低的药物的效用,而且还会导致机体承受潜在的副作用.靶向给药系统可精确地将药物运送到靶向部位,作用于靶向组织、细胞甚至胞内特定细胞器,不但可以最大化药物的效用,而且还可以有效降低药物对机体的副作用.因此,设计开发出针对急性心肌梗死治疗的靶向给药系统,不但可以实现快速高效的药物靶向释放,最大化药物的效用,而且还可降低药物对其他器官或组织的副作用. 因此,在本研究中,针对急性心肌梗死导致细胞死亡的3个不同原因,我们分别以Sirt3、OMA1以及NLRP3炎症小体作为靶点筛选不同的候选药物,同时设计开发PLGA-PNIPAM 微球、MMP9 酶-pH 响应系统以及 α-环糊精覆盖 N-Propyl-2-Pyridinamine 的改性介孔二氧化硅纳米颗粒的药物靶向递送系统,通过不同的递送系统实现对筛选出的化合物的靶向递送,发挥药物的生物学功能,从而改善急性心肌梗死后的心功能.我们具体从以下四个方面开展研究. 一、小分子化合物的筛选及鉴定 以Sirt3、OMA1以及NLRP3炎症小体作为靶点,以目前已知的小分子化合物作为筛选对象,在蛋白质数据库中查找并下载Sirt3和OMA1的3维蛋白结构作为目标蛋白,利用Sybyl-X 2.0软件中的分子对接模块模拟小分子化合物与蛋白质的结合.在小分子筛选中,定义目标蛋白质为受体分子,寻找出受体可能结合的区域,即活性位点,将小分子化合物放置于活性区域,按照能量互补、几何互补以及化学环境互补的原则评价小分子化合物与蛋白质相互作用情况,同时找出最佳结合模式,最后利用打分函数对所有的小分子化合物与目标蛋白相互作用程度进行打分排序,选择得分最高的5个小分子进行后续生物学研究.我们成功筛选出Sirt3和OMA1的潜在激动剂或抑制剂,而 NLRP3 炎症小体由于是复合物,其三维结构未知,未能筛选出小分子抑制剂,但通过文献查阅,我们寻找到NLRP3炎症小体的抑制剂. 二、PLGA-PNIPAM微球包裹NaB在急性心肌梗死中通过激活Sirt3改善心功能不全 Sirt3 是一种组蛋白去乙酰化酶,通过激活该蛋白酶的活性位点可有效促进 Sirt3的生物学功能.在小分子筛选研究中发现,NaB可特异性地与Sirt3结合,促进Sirt3的生物学功能.NaB作为一种胃肠道营养物,是一种短链脂肪酸,具有提供能量的作用.急性心肌梗死是一种因能量缺乏而引起心肌细胞死亡的疾病,因此,NaB有可能作为治疗急性心肌梗死的一种能量来源.为了能长时间局部释放 NaB,我们设计了PLGA-PNIPAM 温度敏感性凝胶微球,并包裹 NaB形成 PP-N.在大鼠急性心肌梗死模型中,将PP-N微球多点注射到梗死区域周围,由于PP-N的温度敏感性及凝胶特性,使得微球可长时间聚集在注射区域,缓慢释放 NaB.研究结果发现,注射 PP-N 后,释放的NaB可通过特异性地与Sirt3结合,促进Sirt3的去乙酰化能力,进而有效抑制活性氧ROS的产生;激活梗死区域心肌细胞和内皮细胞的自噬,促进其存活;长时程的作用则可有效促进血管新生,改善梗死区域的血供,最终改善急性心肌梗死的心功能.因此,我们研究结果表明,NaB作为一种胃肠道营养物质,可有效保护梗死区域的细胞,NaB与PLGA-PNIPAM微球的有效结合有可能作为急性心肌梗死的一种新的治疗方案. 三、酶-pH 反应系统包裹 UNC0638 在急性心肌梗死中通过精确靶向抑制线粒体OMA1有效改善心功能不全 线粒体作为细胞能量的主要来源,线粒体的活性及数量直接影响着细胞的存活.在正常的细胞中,线粒体处于分裂与融合的动态平衡中,然而在濒死的细胞中,线粒体分裂远远大于融合,使得线粒体失去能量供给,加速细胞死亡.在急性心肌梗死中,半暗带区域的心肌细胞处于濒死状态,心肌细胞的线粒体大量分裂,而在梗死发生24小时内挽救这部分濒死的心肌细胞是改善心功能的最佳途径.我们通过小分子化合物模拟筛选鉴定UNC0638可特异地与促线粒体分裂蛋白OMA1结合,抑制其活性.急性心肌梗死发生后,梗死区域的 MMP9 蛋白酶水平显著升高,在梗死早期,胞外的pH值并没有显著改变,但是在濒死的心肌细胞中,其胞内 pH值则低于 6.5.根据这一特性,我们设计了MMP9蛋白酶和pH双重响应的药物靶向系统,并装载UNC0638,用于改善急性心肌梗死的心功能.实验表明,该系统表面负电荷的设计可有效避免血液系统中免疫细胞的吞噬,而以MMP9蛋白酶底物为基础合成的递送系统的外壳可实现对梗死区域的靶向作用,内壳中基于α-环糊精覆盖N-Propyl-2-Pyridinamine修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒的设计则保证了系统只有在 pH小于 6.5 的环境中实现 α-环糊精脱落并释放药物,而 N-Propyl-2-Pyridinamine 的正电荷效应则促进其可聚集在表面带负电荷的线粒体周围,实现药物靶向释放到急性心肌梗死中半暗带区域的濒死的心肌细胞中的线粒体周围,从而抑制OMA1的活性,抑制线粒体分裂,保护濒死的心肌细胞,最终改善心功能.因此,我们的研究不但为急性心肌梗死的治疗提供了一种新的候选治疗药物,而且还提供了一种精确、及时高效的胞内靶向释放系统,新药与新的递送系统的有效结合可成为急性心肌梗死临床治疗的潜在方案. 四、免疫逃避递送系统装载NLRP3炎性小体抑制剂MCC950改善急性心肌梗死的心功能 能量供给缺失是造成梗死区域心肌细胞死亡的重要内部原因,而心肌梗死诱发的固有免疫反应导致微环境的恶化则是促进濒死的心肌细胞死亡的一个重要外部原因.在固有免疫反应中,NLRP3炎性小体促进炎性因子的释放,大量的炎性因子聚集则会加速濒死的心肌细胞的死亡,从而扩大梗死面积.我们通过大量文献查找,寻找到小分子化合物MCC950可特异高效地抑制NLRP3炎性小体的活性.基于前期设计合成的免疫逃避药物递送系统对MCC950进行装载,递送系统表面的负电荷设计可有效逃避免疫细胞的吞噬,同时在酶对底物的吸引的作用下,递送系统可在急性心肌梗死发生的2小时内快速大量地将MCC950递送到梗死区域,抑制NLRP3炎性小体的活性,进而抑制炎性因子的释放,改善梗死区域微环境,保护濒死的心肌细胞,进而改善心功能.因此,我们的研究表明MCC950可作为急性心肌梗死治疗的潜在药物,而免疫逃避药物递送系统可及时高效地将药物运送到目标区域,这两者的结合给未来急性心肌梗死的治疗提供了潜在方案. 我们的研究通过对急性心肌梗死发生后生物改变进行研究分析,以机体的相关重要调控分子的改变作为研究靶点,筛选鉴定出靶点分子特异的激动剂或抑制剂,同时还设计研发出多种基于生物学改变的药物靶向递送系统,实现对目标分子的靶向治疗.因此,我们研发出的小分子化合物与药物靶向递送系统的结合可为未来急性心肌梗死的临床治疗提供有效的治疗方案.
急性心肌梗死;小分子药物;能量代谢;免疫反应;再生修复
陆军军医大学
博士
人体解剖与组织胚胎学
朱楚洪
2018
中文
R542.22
2019-01-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）