软骨细胞分化与肥大化相关lncRNA筛选及其作用机制研究
研究背景： 骨关节炎和创伤是导致关节软骨损伤的两个最常见原因。骨关节炎是一种关节软骨退化性病变。随着病变程度的加重，软骨基质合成速度逐渐低于降解速度，软骨表面开始纤维化，并损伤软骨内部。继而炎症破坏潮线，血管向软骨内生长并导致纤维样软骨形成，最终导致软骨功能丧失。严重的创伤性软骨损伤穿透潮线，软骨下骨的脉管系统进入软骨区激活组织的炎症反应，血管中的间充质干细胞沉积在纤维蛋白网络中，最终形成纤维软骨，严重影响软骨的功能。关节软骨是一种透明软骨，其胶原原纤维的主要成分是Ⅱ型胶原蛋白，胶原蛋白纤维网络包裹蛋白多糖和糖蛋白，使软骨组织具有机械弹性。同时，关节软骨中没有血管，因此软骨细胞需要的营养物质和其他细胞因子只能从关节滑液和软骨下骨中获得。由此可见，关节软骨自身修复能力有限，如何恢复损伤后关节软骨的功能是医学领域的一大难题。 目前用于修复软骨缺损的方法有多种，但均存在各式各样的弊端。组织工程学是一个不断发展的多领域交叉学科，有望为软骨缺损修复提供新的解决方案，其中种子细胞的选择是构建组织工程软骨的重点。间充质干细胞（MSCs）扩增迅速，来源广泛，并具有多向分化潜能，现已成为软骨组织工程中潜力最大的种子细胞。然而，在组织工程软骨的构建过程中，MSCs来源的软骨细胞很难维持细胞外基质代谢平衡，部分成熟软骨细胞开始表达软骨细胞肥大化标志基因，使得软骨细胞稳态破坏，严重影响关节软骨缺损的修复和功能重建。软骨细胞肥大化同时也是组织工程软骨修复过程中出现纤维软骨的原因。因此，抑制MSCs成软骨分化后的肥大化进程，维持软骨细胞的基质代谢平衡，是改善组织工程学技术应用于软骨修复的重中之重。 越来越多的证据表明，非编码 RNA（ncRNA）对细胞的各种生物学行为有重要调控作用。相比之前大热的微小RNA（microRNA），长链非编码RNA（lncRNA）在细胞内具有更高的转录比例，并且可折叠成复杂高级别结构，因此其生物学功能更加复杂。LncRNA可通过不同的机制在转录以及转录后水平调控靶基因表达以影响多种病理生理进程。然而，lncRNA 对软骨细胞生物学行为的调控目前尚未可知。因此，本课题拟筛选与间充质干细胞成软骨分化和后续肥大化进程相关的 lncRNA，研究某特定 lncRNA的作用和分子机制，并验证该lncRNA是否可作为标志物进行筛选抑制软骨细胞肥大化的植物提取物。这将为优化组织工程软骨的种子细胞以及研发防治关节炎的药物提供新思路和新策略。 研究方法： 1.软骨细胞分化与肥大化体外模型的建立及其lncRNA表达谱检测 （1）通过茜素红染色、番红O染色和油红O染色鉴定C3H10T1/2细胞系成骨分化，成软骨分化和成脂分化潜能；（2）通过阿尔新蓝染色、免疫化学染色、qPCR和WB技术检测分化过程中标志基因和功能基因的表达以评估软骨细胞分化与肥大化体外模型是否成功建立； （3）通过microarray芯片技术检测软骨细胞分化与肥大化前后的mRNA和lncRNA表达谱； （4）筛选出两阶段中表达上调或下调的mRNA和lncRNA进行聚类分析，并通过 qPCR 验证芯片结果； （5）根据 qPCR 结果筛选出两阶段中表达上调的lncRNA，利用siRNA干扰其表达，通过qPCR和WB技术检测标志基因和功能基因的表达，以验证该lncRNA对软骨细胞分化与肥大化的调控作用； （6）结合芯片结果，通过共表达分析，构建上述lncRNA与mRNA的共表达网络，并利用GO分析和KEGG Pathway分析初步推断上述lncRNA调控软骨细胞分化与肥大化的机制。 2. LncRNA-32598调控软骨细胞分化与肥大化的分子机制研究 （1）根据前期的芯片结果与生物信息学分析筛选出感兴趣的目的 lncRNA （NONMMUT032598）并进行 qPCR 验证； （2）通过构建慢病毒载体上调或者下调lncRNA-32598的表达，利用qPCR、WB、阿尔新蓝染色和免疫化学染色在细胞和组织层面检测标志基因和功能基因的表达以检测lncRNA-32598对软骨细胞分化与肥大化的调控作用； （3）通过荧光原位杂交实验（FISH）检测 lncRNA-32598 在细胞中的定位； （4）通过生物信息学预测与双荧光素酶基因报告系统验证 lncRNA-32598 与靶microRNA 的直接结合关系； （5）通过改变 lncRNA-32598 或靶 microRNA的表达验证lncRNA-32598是否通过结合该microRNA调控软骨细胞分化与肥大化； （6）通过RNA pull down联合质谱分析检测lncRNA-32598在细胞核内结合的靶蛋白； （7）通过RNA免疫共沉淀反向检测靶蛋白与 lncRNA-32598 的结合关系； （8）干扰 lncRNA-32598 与靶蛋白的表达后，通过染色质免疫共沉淀检测软骨细胞分化与肥大化关键调控基因增强子区的转录因子募集情况； （9）通过改变 lncRNA-32598 或靶蛋白的表达验证lncRNA-32598是否通过结合该蛋白调控软骨细胞分化与肥大化。 3. 以LncRNA-32598作为标志物筛选抑制软骨细胞肥大化的植物提取物 （1）通过qPCR检测不同植物提取物对软骨细胞lncRNA-32598表达的影响并以此为根据推测该植物提取物对软骨细胞肥大化的作用； （2）通过CCK8实验和流式细胞术检测不同植物提取物对细胞增殖和凋亡的影响以确定用于后续实验的安全浓度； （3）通过qPCR、WB、阿尔新蓝染色、免疫化学染色和免疫荧光染色检测标志基因和功能基因的表达以推断植物提取物对软骨细胞肥大化的调控作用； （4）通过qPCR和WB检测肥大化相关转录因子或经典通路中核心分子的表达以阐明植物提取物影响软骨细胞肥大化进程的潜在机制。 研究结果： 1.间充质干细胞成软骨分化与软骨细胞肥大化诱导前后，mRNA与lncRNA的表达有明显差异；经验证，大部分芯片数据与qPCR结果一致；在软骨细胞分化阶段，lncRNA 50450，37692和16667表达上调，干扰其表达后，软骨细胞分化标志物表达下降；在软骨细胞肥大化阶段，lncRNA Gm6166，Gm14328和Gm13998表达上调，干扰其表达后，软骨细胞肥大化标志物表达下降；构建了上述lncRNA与潜在靶mRNA的共表达网络， GO分析与KEGG Pathway分析推测软骨分化相关的lncRNA与溶酶体和吞噬有关，细胞肥大化相关的lncRNA与细胞外基质有关。 2. LncRNA-32598在软骨细胞分化阶段表达上调在细胞肥大化阶段表达下调；其表达上调促进软骨分化标志基因的表达而抑制肥大化标志基因的表达；其表达下调抑制软骨分化标志基因的表达而促进肥大化标志基因的表达。FISH检测证实，LncRNA-32598在细胞质与细胞核中均存在。LncRNA-32598 能够直接靶向结合 miR-145a-5p 和miR-509-5p，miR-145a-5p靶向Sox9的3’UTR并抑制其转录后翻译，miR-509-5p靶向Id1的3’UTR并抑制其转录后翻译，进而下调Sox9的表达；LncRNA-32598与FXR1有直接结合关系，lncRNA-32598/FXR1促进STAT3与Sox9启动子的结合。 3.虫草素、姜黄素、花椒毒素、双氢青蒿素以及花青素均可促进lncRNA-32598的表达，而白藜芦醇则抑制lncRNA-32598的表达；虫草素、姜黄素、花椒毒素、双氢青蒿素以及花青素均可在核酸及蛋白水平抑制软骨细胞肥大化标志基因的表达；虫草素下调PI3K和Notch通路的表达，姜黄素下调IHH通路和Notch通路的表达，花椒毒素抑制p38磷酸化并上调HDAC4的表达，双氢青蒿素下调Pax6和IHH通路的表达，花青素抑制NF-κB通路激活和细胞自噬。 结论： 1. LncRNA在软骨细胞分化与肥大化过程中可能有重要调控作用；LncRNA 50450， 37692和16667可能通过调控细胞自噬促进软骨细胞分化；LncRNA Gm6166，Gm14328和Gm13998可能通过影响细胞外基质代谢促进软骨细胞肥大化进程。 2.在细胞质中，lncRNA-32598通过竞争性结合miR-145a-5p和miR-509-5p促进Sox9的表达；在细胞核中，lncRNA-32598与FXR1直接结合促进STAT3在Sox9启动子区的募集，上调Sox9的表达，最终促进软骨细胞分化抑制软骨细胞肥大化。 3.根据各植物提取物对lncRNA-32598表达的影响，推测虫草素、姜黄素、花椒毒素、双氢青蒿素及花青素可能抑制软骨细胞肥大化，经验证，结果证实了该推测。lncRNA-32598有望作为生物标志物，进行抑制软骨细胞肥大化的植物提取物的筛选。
软骨分化;肥大化进程;间充质干细胞;lncRNA表达谱;植物提取物
陆军军医大学
博士
人体解剖与组织胚胎学
董世武
2018
中文
R681.3
2019-01-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）